Procedimiento para la transformación de los cladodios de cactus Opuntia jicus-indica secos para producir bioetanol de segunda generación.
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención forma parte del desarrollo de biocombustibles a partir de la biomasa Hgnocelulósica no alimentaria para hacer frente al agotamiento de los recursos de la energía fósil.
ESTADO DE LA TÉCNICA
El notable agotamiento de los recursos energéticos fósiles y el coste que estos suponen, así como las exigencias reglamentarias del desarrollo sostenible, son los principales argumentos a favor del desarrollo de este invento.
Las bio·refinerias son los principales productoras de energías renovables produciendo metano, hidrogeno, bioetanol y biodiesel (Lens, 2005). Por otro lado, la biornasa lignocellulosica constituye un sustrato adecuado. seguro. abundante y con un gran potencial para las biorrefinerías (Kumar et al. 2009).
Las plantas verdes producen aproximadamente 170 Gtonelada de biomasa seca/año donde 10 Gtoneladas/año serán explotadas con fines energéticos en el horizonte 2050 (que representa el 15% de la demanda energética mundial total) (Lens. 2005). Entre los recursos de biomasa lignocelulósica podemos citar: los residuos y co-productos agricolas (bagazo de la caña de azúcar. tallo de algodón. la paja de trigo, la paja de arroz, la madera.... etc.). los residuos agro-industriales. el compost. los residuos sólidos urbanos y los cultivos energéticos no-alimentarios que producen 300 millones de toneladas de biomasa seca por año (Lens. 2005).
A pesar del espectacular desarrollo de los cultivos del cactus en Túnez, la explotación de esta especie queda restringida a la producción y la comercialización de tunas. Los cladodios que constituyen la mayor parte de la especie en biomasa son muy poco explotados a pesar de su composición química rica en nutrientes. Opuntia es una planta suculenta con tejidos que permiten el almacenamiento del agua lo que convierte a Opuntia en la planta más eficaz para la conversión del agua en materia seca con respecto a otras plantas grasas. Así, algunas especies de Opuntia producen 26 toneladas de MSlhectárea/año.
De la misma manera, se ha estimado la cantidad de biomasa producida por los cladodios y los frutos de cactus en los climas áridos, semi-áridos así como los suelos de regadío. La especie Opuntia ficus-indica cultivada en condiciones optimas, asegura una producción anual de biomasa que puede exceder las 30 toneladas de MSlhectárea/año según se muestra en la Tabla I (Harndi, 2006).
Tabla 1: La producción teórica de la biomasa de cactus en función de las condiciones bioclimáticas (Harndi, 2006).
Regiooes CUma Árida Semi--árida Regadío Talla (m x m) Plantaslhectárea
Cladodios Frutos
4x4
2, 63 0, 79
Materia vegetal
2x2
Biomasa (toneladaslhectárea) 10, 5
3, 15
xl 5000
6, 3
Por otro lado, la especie Opuntia presenta la tasa de producción de biomasa más
elevada de las plantas invasoras en Túnez. Además. la producción de biomasa del
1S cactus aumenta todavía más, a pesar del aumento atroz y peJjudicial de las
concentraciones de C02 atmosférico. De este modo, el desarrollo del cactus puede
llegar a frenar el efecto invernadero (Florian et aL , 2005). Por tanto, los cladodios
de cactus pueden servir como soporte naturaJ para la captura y secuestro de
dióxido de carbono.
20 Hasta la fech a, las patentes relativas a la producción de bioetanol de segunda
generación a partir de la biomasa lignocelulósica principaJmente emplean los
siguientes sustratos:
El bagazo de la caña de azúcar (US 2010/ 0330638 Al. Dec.30, 2010) ; Los residuos agrícolas: madera dura y blanda, residuos forestales, lodos de la industria papelera, residuos sólidos industriales y municipales, diferentes plantas herbáceas (la paja, el maíz, el sorgo, el trigo, la cebada, el arroz, la soja) (WO 2011 1 137150 Al. Nov.03, 2011) (WO 20111 137147 Al. Nov.03, 201 1) ; El pino, el roble y algunas plantas perennes (WO 2011 1 136616 A2. Nov.03, 2011).
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN.
El objetivo principal de la presente invención es la transfonnación de los cladodios de cactus secos «Opuntia jicus-indica» mediante la aplicación de los pre-treatamientos tennoquímicos y sacarificcacion enzimática para extraer los azucares fennentables y asi producir bioetanol de segunda generación mediante la fermentación alcohólica. Esta invención pennite por una parte valorizar exclusivamente los recursos de biomasa lignocelulosica disponible y no explotada y por otra parte, contribuye en el desarrollo de biocarburante de segunda generación como fuente de nergía renovable limpia.
El sector de las energías renovables podrá beneficiarse de las ventajas notables de esta invención en e! plan de! desarrollo de los biocarburantes y favorecer así la independencia energética de las energías fósiles. De este modo, el agotamiento notable de los recursos en energías fósiles y las exigencias dictadas para e! desarrollo sostenible son los principales argumentos a favor de esta invención.
Los cultivos de Opuntia spp., extendidos por todos los países mediterráneos, y específicamente en Túnez, representan un recurso renovable importante de la biomasa lignocelulósica no alimentaria, que está disponible e ¡nexplotado (En algunos casos se utiliza como alimento de animales).
Cabe destacar que los cladodios de cactus son sustratos ricos en materia orgánica seca compuesta principalmente por carbohidratos (Nefzaoui, et al, 2002) , lo que justifica su utilización para producir bioetanol.
S 10 La invención tal y como se detalla posterionnente, está basada en la aplicación de una serie de técnicas de pre-tratamiento mecánico (etapa 1) , pre-tratamiento termoquímico acido (etapa 2) , sacarificación y fennentación alcohólica simultanea (SSF) (etapa 3) y destilación (etapa 4) , con e1 objetivo de extraer a la vez los azucares fennentables de la matriz lignocelulosica de los cladodios de cactus y convertirlos a bioetanol de segunda generación. A continuación se describe brevemente cada etapa:
Etapa 1. Pre-tratamiento mecánico de trituración, para reducir el tamaño de las fibras a un diametro medio de las particulas de I mm. Esta etapa tiene como objetivo disminuir el grado de polimerización de la celulosa y de la lignina y
15 aumentar la superficie de contacto, y por tanto, la accesibilidad de la celulosa y la hemicelulosa a los diferentes reactivos.
Etapa 2. Pre-tratamiento termoquímico ácido en atmósferea inerte en presencia de N2, a una temperatura de 175 oC, una presión de 5 bares, una concentración del
20 ácido sulfúrico H2S04 de 0, 06 % (mlv) , durante un tiempo de contacto de 75 minutos. Esta etapa tiene como objetivo la hidrólisis de la fracción hemicelulósica de la biomasa de los cladodios de cactus secos y así poner la fracción celulósica más accesible a la digestión enzimática ulterior.
25 Etapa 3. Sacarificación y fermentación simultanea (SSF) mediante el empleo de Wla mezcla enzimática, con las actividades endocelulasa y exocelulasa (fJglucosidasa) asi como las actividades xilanasas, e inoculando las levaduras Saccharomyces cerevisiae y Pachyso/en tannophi/us ATCC 32691 para convertir los disacaridos (sacarosa) y los monosacaridos fermentables en C6 (glucosa, fructosa..) yen C5 (principalmente xilosa) procedentes de la digestión enzimática simultánea de la fracción celulósica del pretratamiento termoquímico ácido.
Etapa 4. Destilación (separación líquida/vapor) para aumentar el contenido en alcohol del mosto obtenido.
DESCRIPCIÓN DEL CONTENIDO DE LAS FIGURAS
Figura 1. Representa un diagrama detallado de las etapas del procedimiento de la transfonnación de las fibras de cactus para la producción del bioetanol de segunda generación.
Figura 2. Representa la curva relativa a la isotenna de adsorción de las fibras de cactus secos, pennitiendo el estudio del comportramiento de estas fibras con respecto al agua, calculando la cantidad máxima de la adsorción del agua por las fibras de cactus.
Figura 3. Representa la cinética de la sacarificación de la suspensión de fibras de cactus al 10% en materia seca en presencia de 100 rnglg de la enzima CeIlic®Cetc2 diluida 10 veces.
Figura 4. Micrografias fotónicas (3X) de las fibras de los cladodios de cactus secos brutos (a) y trituradas (b).
Figura 5. Micrografias Electrónica de Barridos, MEB, de las fibras de los cladodios de cactus secos (370 X) (e) y sus poros (1500 X) (d).
MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN La estrategia experimental adoptada en esta invención tiene como objetivo operar en condiciones óptimas y favorables, con la aplicación de pre-tratamientos que favorezcan la hidrólisis de las fracciones lignocelulósica dificiJes de biodegradar y menos asimilables por un proceso de tratamiento biológico.
El procedimiento para la transfonnación de los cladodios de cactus secos Opuntia ficus-indica mediante el pre-tratamiento mecánico y tennoquímico ácido, así como la saccarificación y la fennentación simultanea (SSF) , seguida de una etapa de destilación, con el objetivo de obtener el bioetanol de segunda generación esta ilustrado en la Figura 1.
A continuación se detalla el procedimiento aplicado a las muestras de c1adodios secos de cactus procedentes de la bioc1imática árida de Túnez.
Ensayo t. Pre-tratamiento mecánico y caracterización fisicoquímica y estructural de las fibras de cactus.
El pre-tratamiento mecánico empleado consistió en la trituración, mediante un molino de martillo tipo (Leshan Dongchuan Machiner y Co. Ud Sichuan, China).
El estudio estructural de las fibras lignocelulósicas crudas de la biomasa vegetal, previamente trituradas, se realizó mediante la observación microscópica fotónica y electrónica de barrido MEB. Las Figuras 4 y 5 muestran la estructura fibrosa de los cladodios de cactus secos. Las rnicrograflas electrónicas han puesto en evidencia la unifonnidad de la superficie porosa de las fibras de cactus con un diámetro de poro de 10 Jlm aproximadamente.
La caracterización fisicoquímica de los cladodios secos de cactus ha permitido determinar la materia seca contenida en los residuos, la densidad de la fibra, el volumen de inflado de las fibras dentro del agua así que la capacidad de retención del agua y del aceite. Estas características se encuentran recogidas en la Tabla 2.
Tabla 2. Características fisico-químicas de los c1adodios de cactus.
Características fIslcD-9ufmicas Valores
Materia seca (%) 96, 122 ± 1, 482
Contenido en cenizas (%) 8, 568 ± 0, 326
Contenido en agua (%) 3, 878 ± 1, 482
Densidad de párticulas de las fibras con respecto al iso-butanol 2, 688 ± 0, 056
Volumen de hinchazón de las fibras en el agua (mUg) 2, 649 ± 0, 158
Capacidad de retención del agua (g de agua! g MS) 2, 157 ± O, 769
Capacidad de retención del aceite (aceite de girasol) (mi de aceitelMS) 4, 978 ± 0, 117
Contenido en proteínas (%) 2, 155 ± 0, 158
El estudio del comportamiento de las muestras de cactus secos con respecto al agua se efectuó estableciendo isotennas de adsorción del vapor de agua a 20°C (Figura 2).
El diagramade absorción del agua pennite el seguimiento de la hidratación de las fibras de cactus en función de la actividad del agua en el medio. El contenido máximo de agua que pennite fijar las fibras de cactus es del orden del 15, 36% (glloog MS).
La composición en a-celulosa, hemiceJulosa, lignina. carbono organico total
(COT) , carbono inórganico (C ing) , carbono total (C tot) y nitrógeno total (N tot) de los cladodios secos de cactus se recogen en la Tabla 3.
Tabla 3. Composición en a-celulosa, hemicelulosa, Jignina, carbono orgánico total (COT) , carbono inorgánico (C ing) , catbono total (C tot) y nitrógeno total (N tot) de los cJadodios secos.
Componente Valor ('lo)
a-Celulosa 50
Hemicelulosa 18
Lignina 27
COT 6, 206 ± 0, 001
e ¡ng 0, 451 ± 0, 008
e tot 6, 705 ± 0, 173
N tot 1, 878 ± 0, 041
En efecto el contenido en holocelulosa y en lignina de los cladodios de cactus secos confinna la naturaleza lignocelulosica de las muestras de cactus seco.
Ensayo 2. Pre-tratamiento termoquímico ácido de las fibras de cactus.
S Una vez trituradas con un molino de martillos (Leshan Dongchuan Machiner y Co. Ltd Sichuan. China) y caracterizadas exhaustivamente, las fibras de cactus seco fueron pre-tratadas mediante un pre-tratamiento tennoquímico ácido utilizando un reactor a presión (Pan®, series 4600-4620) de un litro de volúmen útil, equipado de válvulas de control de presión y temperatura; la regulación de la presión se hace mediante una válvu1a neumática con un compresor auxiliar.
10 El reactor a presión utilizado en esta etapa de pre-tratamiento es de tipo 'batch'. sin agitación. Este reactor se llenó al 10% de su capacidad total con una suspensión de fibras al 10% en sólidos totales. Para generar un ambiente inerte dentro del reactor se empleó nitrógeno a una presión fija.
15 Las condiciones empleadas para el pretratamiento termoquímico ácido de las fibras secas del cactus empleadas fueron de una presión de 5 bares, 1750C de temperatura, con la adición del ácido sulfurico H2S04 a una concentración del 0, 06% Y un tiempo de reacción de 75 minutos.
El análisis de la composición de las fibras de cactus después del pre-tratamiento tennoquímico está presentado en la Tabla 4.
Tabla 4. Análisis de la composición de las fibras de cactus antes y después del pre-tratamiento termoquímico.
Componente Antes del pre-rrQtamiento Después del pre-trQtQmiento
Carbono total soluble (%) 6, 705 11, 85
Xilosa (%) 0.577 5, 350
Glucosa (%) O 0, 360
Fructosa ('lo) O 0, 539
Sacarosa (%) O 0, 107
Acidez volátil total (%) O 0, 50
Hidroxi-metil-furfural (%) O O
a-Celulosa (%) 50, 00 55, 17
Hernicelulosa ('lo) 18, 00 1, 82
Lignina (%) 27, 00 15, 36
Cenizas ('lo) 8, 24 7, 90
El contenido en carbono total soluble (orgánico y inorgánico) se detenninó mediante un equipo automático de carbono y nitrógeno (multi N/e3100 analyzer de Analytic Jena) utilizando una fase mobile de H3P04 al 10%. El contenido en azucares se ha detenninado mediante un kit enzimático. La acidez volátil total (expresada por gramos de ácido acético por cada IOOg de muestra) ha sido detenninada mediante un cromatógrafo de gases de Shimadzu GC201O. Los ácidos grasos volátiles de cadena corta delenninados son el acético, propiónico, isobutírico, butírico, isovalérico, valérico, isocaproico, caproico y heptanoico. El contenido en hidroxi-metil-furfural (HMF) se detenninó por cromatografia gaseosa.
Ensayo 3. Sacarificación enzimática de las fibras de cactus pre-tratadas.
A continuación se realizó un estudio de la sacarificación enzimática de las fibras de cactus secos pre-tratados. Esta hidrólisis enzimática se realizó preparando suspensiones de fibras de cactus al 10% en materia seca con una concentración de la enzimas comercial CelliC®Cetc2 de 100 mg/g, diluida 10 veces a un pH de 4, 8 y a una temperatura de 50 ± 1°C con una velocidad de agitación de 150 rpm mediante microincubadores. La duración de la sacarificación enzimática fue de 72 horas.
La CelliC®Cetc2 es una preparación enzimática de la marca Novozymes, con una concentración en proteinas totales de 217 giL. una actividad de papel filtro de 120, 5 FPUlrnL y una actividad ~-glucosidasa de 2731 U/rnL.
El análisis de los azúcares por cromatografia gaseosa pennitió estudiar la cinética de la sacarificación enzimática, igualmente, el contenido en glucosa ha sido detenninado con una técnica enzimática. Así, la Figura 3 muestra con detalles la cinética de la sacarificación enzimática de las fibras de cactus pre-tratadas.
Con este ensayo de sacarificación se alcanzó un rendimiento de glucosa de 19~1 O % ± 0, 530. y una materia seca residuaJ de 5, 50 % ± 0, 36.
La composición en azúcares de las fracciones líquidas de la materia hidrolizada realizada mediante cromatografia gaseosa sepresenta en la Tabla 5.
Tabla 5. Composición en azúcares liberados durante la sacarificación enzimática de las fibras pre-tratadas del cactus seco, detenninadas mediante cromatografia gaseosa.
Hidrólisis del eatíu, al 10% en materia seca y 100 mg/g de enzima
EIp. CelobiOla Loct... GlueOl. XiIos. Ga....... Arabinosa M'ROIa
Patron 24 h 0, 093
Patron 48 b 0, 319 0, 079 0, 082
Patrón 12 b 0, 47 0, 144
Muestra 24 h 10, 027 0, 681 9, 237 2, 602
Muestra 48 b 8, 233 8, 3 l 8 2, 268
Muestra 12 h 8, 07 0, 825 8, 936 2, 458
·Los contenidos en azúcares están expresados en gIL. Las concentraciones están determinadas después de 72 horas de hidrólisis. Ensayo 4. Sacarificación y fermentación simultanea (SSF) de las fibras de cactus pre-tratadas termoquímicamente en medio ácido con la levadura 10 Saccharomyces cerevisiae y la enzima Cellic®Cetc2.
El objetivo de esta etapa es mejorar la eficacia del procedimiento, particulannente con respecto a la variable tiempo de reacción y de la concentración final en etanol. Para ello se preparó una suspensión de fibras de cactus al 14% en materia seca preparada con el tampón acetato de sodio a 50 mM a un pH de 4, 82 con el 3% de la disolución de cloranfenicol al 0, 2% preparada en el tampón de acetato para evitar contaminaciones bacterianas a lo largo de la reacción.
De la misma manera, se añadió al medio de la SSF una suspensión de la enzima Cellic®Cetc2 a 100 mglg. diluida 10 veces a razón de 0, 70 vlv con respecto al volúmen total de la reacción. El medio de la reacción fue inoculado al 10% con la 20 levadura Saccharomyces cerevisiae procedente de un medio de cultivo líquido sintético de 20 giL de azúcares a pH de 4, 2. La composición de este medio de cultivo consta de extracto de levadura (4, 00 giL) , peptona de caseina (3, 60 giL) , (N\-4) , SO, (3, 00 giL). MgSO, 7H, O (2.05 giL) , KH, PO, (2, 00 giL) , xilosa (5 giL) ; glucosa (10 giL) , fructosa (2, 5 giL) , Y sacarosa (2, 5 giL). Para favorecer el 25 crecimiento de Saccharomyces cerevisiae durante la SSF se añadió un medio de
S cultivo líquido sintético concentrado 25 veces con una concentración de 0, 025 v/v con respecto al volúmen total. Este medio de cultivo concentrado tiene la composición siguiente: Extracto de levadura (50 giL) , peptona de caseina (45 giL) , (NH, hSO, (37, 5 giL) , MgSO, 7H, O (25, 625 giL) , Y KH, PO, (25 giL) ; todos los reactivos se ajustaron a un pH de 4, 28.
La SSF se desarrolló en un microincuhador operando a una 35±1°C con agitación fija a 150 rpm durante 120 horas (5 días). temperatura de
10 La producción de etanol obtenida al final del proceso de SSF se analizó mediante cromatografia gaseosa (OC) y usando un kit enzimatico (Boehringer Manheim, Cat. nO 176290) adaptado que permite calcular el rendimiento final de la conversión de glucosa a etanol. El rendimiento obtenido fue del 75% con respecto al rendimiento de conversión teórica. La concentración final obtenida en etanol ha sido de 0, 5 giL.
15 Ensayo 5. Sacarificación y fermentación simultanea (SSF) de las fibras de cactus pre-tratadas termoquimicamente en medio ácido mediante un cultivo de dos levaduras (Saccharomyces cerevisiae y Pachysolen tannophilus ATCC 32691) y la enzima CelliC®Cetc2
20 En este ensayo se probó la posibilidad de convertir a la vez los diferentes azucares en C6 (glucosa y fructosa) yeneS (xi losa). asi como los disacáridos (sacarosa) producidos durante la digestión enzimática. Este objetivo se alcanzó mediante el emplo de un cultivo mixto de dos levaduras: Saccharomyces cerevisiae y Pachysolen tannophi/us durante la SSF.
25 Para alcanzar el objetivo, se elaboró un protocolo experimental del establecimiento de la SSF similar al que esta descrito previamente en el ejemplo 4, sobre el que se aplicaron las modificaciones siguientes: el medio de reacción fue inoculado al 10% con el cultivo mixto de las dos levaduras Pachysolen tannophilus y Saccharomyces cerevisiae con una proporciones de 46% y de 54% respectivamente provenientes de précultivos diferentes.
La detenninación de la concentración final del etanol producido se detenninó por cromatografia gaseosa (OC) y con el kit enzimático adaptado, siendo esta concentración próxima a 0, 7 giL.
S Ensayo 6. Destilación El objetivo de esta última etapa de destilación es aumentar la concentración de etanol en el producto final de la fennentación. La etapa de destilación consta en una separación líquido-vapor de los componentes de la mezcla obtenida en la etapa anterior mediante una sucesión de vaporización y condensación llevando la mezcla a ebullición (o vaporización) del etanol, cuyo punto de ebullición a 1 atm es de 78, 2 oc.
APLICACIÓN INDUSTRIAL
Los sectores industriales que pueden beneficiarse de este invento son:
• Las empresas que operan en el campo de los biocombustibles, energías renovables o en general toda empresa biotecnológica.
• Las refinerías que quieren desarrollar una línea de energías nuevas y limpias.
• Todas las industrias que tratan los residuos ncos en fracciones
lignocelulósicas, fracciones celulósicas (industria pastero-papelera) o fracciones de polisacáridos (industria de almidón).
• Cualquier empresa de servicio de recogida de residuos agrícolas, forestales, o residuos sólidos urbanos, etc....
