MicroRNA útil para el tratamiento de canalopatías arritmogénicas.
La presente invención se encuadra en el campo de la terapia génica y la cardiología y específicamente se refiere al uso del microRNA hsa-mir-219-5p, de SEQ ID NO: 1, de los polinucleótidos modificados derivados de él, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5, o de sus precursores, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, para la elaboración de medicamentos útiles para el tratamiento de canalopatías arritmogénicas, preferiblemente de aquellas que se deben a alteraciones en la función del canal de sodio cardíaco, más preferiblemente de síndrome de QT largo tipo3y de síndrome de Brugada.
Estado de la técnica anterior
Las arritmias ventriculares constituyen la causa más frecuente de muerte súbita en las sociedades desarrolladas y suelen relacionarse con la existencia de cardiopatía isquémica, de la que pueden ser la primera manifestación en sujetos hasta entonces asintomáticos. Con menor frecuencia ocurre en sujetos sin cardiopatía estructural y más jóvenes. Los avances de la biología molecular en la última década han permitido identificar diversas entidades clínicas que comparten su origen en mutaciones en genes que codifican para subunidades de canales iónicos, los cuales son responsables de la generación del potencial de acción de las células cardíacas. Este conjunto de enfermedades hereditarias se denominan canalopatías arritmogénicas. En los últimos años, se ha avanzado mucho en el conocimiento de la base genética y funcional de distintos síndromes arritmogénicos, entre los cuales cabe destacar el síndrome de Brugada y el síndrome de QT largo.
El síndrome de Brugada es una canalopatía asociada a anomalías en los canales de sodio, concretamente a mutaciones en el gen SCN5A que codifica para la proteína transmembrana Nav1.5, las cuales provocan en todos los casos una falta de función de dicho canal y suele presentarse asociada a arritmias ventriculares polimórficas en sujetos sin cardiopatía. Estos sujetos presentan un electrocardiograma característico: elevación del segmento ST en las derivaciones precordiales derechas y patrón de bloqueo de la rama derecha del haz de His, generalmente con QT normal. Por otro lado, la base genética del síndrome de QT largo tipo 3 ó LQT3 es más heterogénea, aunque hay que resaltar que esta patología también presenta alteraciones moleculares en los canales de sodio debidas a mutaciones en el gen SCN5A, que provocan en este caso una ganancia de función de dicho canal (Jeffrey E. Saffitz, 2005, Circulation, 112:36723674) .
En la actualidad existen tratamientos farmacológicos, como los agentes beta-bloqueantes (Riera A. R., et al., 2007, Cardiology Journal, 14 (1) :97-106) , que permiten modular este tipo de patologías arritmogénicas, si bien tienen una alta variabilidad en su efectividad en función del paciente tratado (Michowitz Y., et al., 2009, Heart Rhythm, 6 (7) :10471049) y además ejercen un efecto sistémico en él, encaminado a paliar pero no a restituir la fisiopatología cardíaca.
Una alterativa a los tratamientos farmacológicos es la implantación de un cardiovertor (ICD) , sin embargo, este mecanismo, además de suponer un elevado coste médico, está contraindicado en pacientes con alto riesgo de sufrir episodios de muerte súbita (Sherrid M. V., et al., 2008, Progress in Cardiovascular Diseases, 51 (3) :237-63) .
Otra posibilidad para el tratamiento de canalopatías arritmogénicas relacionadas con disfunciones en los canales de sodio es el uso de polipéptidos codificados por polinucleótidos que comprenden la secuencia del gen SCN5A con mutaciones que están presentes en los individuos sanos (US2008214457 A1) .
Se sabe que algunas mutaciones en el gen SCN5A conducen a una disminución en la conductancia del canal de sodio, por lo que esta aproximación se plantea como otra posibilidad para controlar las arritmias cardíacas cuya base molecular se encuentre en alteraciones de ganancia de función en los canales de sodio (G. Alex Papadatos, et al., 2002, PNAS, Vol. 99 (9) : 6210-6215) .
Por otro lado, los microRNAs son moléculas de RNA monocatenario de pequeño tamaño (22 nucleótidos aproximadamente) y no codificantes, que se unen a secuencias específicas de las regiones no codificantes (principalmente las 3’UTR) de los RNA mensajeros diana, inhibiendo su traducción y/o desestabilizándolos, lo que provoca igualmente una disminución en la cantidad total de proteína. Existen diversos microRNAs que tienen como diana transcritos que codifican para proteínas de los canales iónicos cardíacos, por ejemplo, el microRNA-195 y el microRNA-1 actúan sobre la expresión del gen SCN5A (Baofeng Yang, et al., 2008, Cardiovascular Research, Vol. 79: 571-580) .
En resumen, es necesario diseñar nuevas estrategias terapéuticas de modulación de la función del canal de sodio para tratar arritmias cardíacas, las cuales restauren la deficiencia biológica del paciente y no se limiten únicamente a paliar la sintomatología de la enfermedad. Por otro lado, estas nuevas estrategias terapéuticas deberían evitar las complicaciones de las actuales terapias con drogas o con el cardiovertor.
Descripción de la invención
La presente invención propone el uso del microRNA hsa-mir-219-5p, de SEQ ID NO: 1, de los polinucleótidos modificados derivados de él, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5, o de sus precursores, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, para la elaboración de medicamentos útiles para el tratamiento de canalopatías arritmogénicas,
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preferiblemente de aquellas que se deben a alteraciones en la función del canal de sodio cardíaco, más preferiblemente de síndrome de QT largo tipo 3 y de síndrome de Brugada.
El pequeño tamaño de los microRNAs, su fácil manipulación, la biodisponibilidad de sus precursores (pre-miR o pre-microRNA) y su elevada estabilidad termodinámica, hacen de ellos moléculas con un alto potencial terapéutico. Además, la conjugación de los polinucleótidos de la invención con, por ejemplo, aunque sin limitarnos, residuos lipídicos, permite su biodisponibilidad en el organismo del paciente al que le son administrados.
Las secuencias polinucleotídicas de la invención o polinucleótidos de la invención, preferiblemente, las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, permiten modular la función del canal de sodio cardíaco a través de su unión al mRNA que codifica para la proteína Nav1.5, o en el caso de los precursores, proporcionando el polinucleótido que se une a este mRNA, lo que arroja la posibilidad de incrementar la función del canal de sodio en pacientes con, por ejemplo, aunque sin limitarnos, síndrome de Brugada, o disminuirla en pacientes con, por ejemplo, aunque sin limitarnos, síndrome LQT3, y de este modo revertir la función biológica alterada en dichas patologías cardíacas, en contraposición con los actuales métodos biomecánicos o farmacológicos que solo permiten mitigar parcialmente la sintomatología de estas enfermedades.
Los inventores demuestran que el microRNA hsa-mir-219-5p, o miR-219a, de SEQ ID NO: 1, es capaz de reducir la expresión del gen SCN5A, el cual codifica para la proteína transmembrana Nav1.5 responsable del potencial de acción en las células musculares cardíacas. El análisis in vitro de este microRNA muestra que su sobreexpresión disminuye la expresión del gen SCN5A hasta un 50% en las células musculares cardíacas auriculares (Figura 3) , reduciendo así su capacidad y ritmo contráctil. Por ello, en la presente invención se propone el uso de este microRNA para la elaboración de medicamentos destinados al tratamiento de canalopatías arritmogénicas, preferiblemente de aquellas canalopatías arritmogénicas cuya causa sean alteraciones en los canales de sodio, más preferiblemente cuando las alteraciones en dichos canales se deban a mutaciones de ganancia de función en el gen SCN5A, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, el síndrome de LQT3.
Además, en la presente invención se han sustituido los tres nucleótidos (CAA) adyacentes al extremo 3’ de la secuencia GAUUGUC o secuencia complementaria al mRNA del gen SCN5A comprendida en la SEQ ID NO: 1, por otros tres nucleótidos (AGC) , de manera que se ha obtenido la SEQ ID NO: 3, polinucleótido que presenta al menos un 85% de identidad con la SEQ ID NO: 1 y que comprende tres sitios complementarios más que esta secuencia con el mRNA del gen SCN5A, por lo que posee una mayor capacidad de unión al mismo que la secuencia del microRNA nativo o SEQ ID NO: 1. Por ello, la SEQ ID NO: 3 también es útil para la elaboración de medicamentos destinados al tratamiento de canalopatías arritmogénicas, preferiblemente de aquellas canalopatías arritmogénicas cuya causa sean alteraciones en los canales de sodio, más preferiblemente cuando las alteraciones en dichos canales se deban a mutaciones de ganancia de función en este gen, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, el síndrome de LQT3.
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de un polinucleótido aislado, de ahora en adelante “polinucleótido de la invención”, que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 60%, preferiblemente con al menos un 75%, más preferiblemente con al menos un 80% y aun más preferiblemente con al menos un 85% de identidad con respecto a la longitud completa de la secuencia SEQ ID NO: 1 para la elaboración de un medicamento, o alternativamente, a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 60%, preferiblemente con al menos un 75%, más preferiblemente con al menos un 80% y aun más preferiblemente con al menos un 85% de identidad con respecto a la longitud completa de la secuencia SEQ ID NO: 1 para su uso como medicamento.
Los términos “secuencia nucleotídica”, “secuencia de nucleótidos”, “ácido nucleico”, “oligonucleótido” y “polinucleótido” se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud que pueden estar o no, química o bioquímicamente modificados. Se refieren, por tanto, a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, tanto de cadena sencilla como de doble hebra.
El polinucleótido de la invención puede obtenerse de manera artificial mediante métodos de clonación y selección convencional, o mediante secuenciación.
En una realización preferida, el polinucleótido de la invención comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 3, la cual presenta al menos un 85% de identidad con respecto a la longitud completa de la SEQ ID NO: 1. En una realización más preferida, el polinucleótido de la invención es SEQ ID NO: 4, secuencia nucleotídica precursora de la SEQ ID NO: 3 que comprende esta secuencia.
Otro aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 3.
Otro aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4.
Por otro lado, en la presente invención se han sustituido tres de los nucleótidos de la secuencia GAUUGUC comprendida en la SEQ ID NO: 1 para obtener un polinucleótido, SEQ ID NO: 5, que presenta al menos un 85% de identidad con la SEQ ID NO: 1 y que comprende tres sitios complementarios menos que esta secuencia con el mRNA del gen SCN5A, por lo que posee una menor capacidad de unión al mismo que la secuencia del microRNA nativo
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o SEQ ID NO: 1. Por ello, la SEQ ID NO: 5 también es útil para la elaboración de medicamentos destinados al tratamiento de canalopatías arritmogénicas, preferiblemente de aquellas canalopatías arritmogénicas cuya causa sean alteraciones en los canales de sodio, más preferiblemente cuando las alteraciones en dichos canales se deban a mutaciones de ganancia de función en este gen, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, el síndrome de LQT3, puesto que, aunque esta secuencia posea menos sitios complementarios que la SEQ ID NO: 1 con el mRNA diana también es capaz de unirse a dicho mRNA y reducir su función; estos medicamentos podrían ser útiles, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en pacientes de síndrome de LQT3 en los que exista una deficiencia en la expresión del microRNA nativo. La SEQ ID NO: 5 también es útil para la elaboración de medicamentos destinados al tratamiento de canalopatías arritmogénicas cuya causa sean mutaciones de pérdida de función en este gen, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, el síndrome de Brugada, ya que esta secuencia compite con el microRNA nativo presente en las células por la unión al mRNA diana reduciendo la capacidad de este último de inhibir la función de dicho gen.
Por ello, en otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el polinucleótido de la invención comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5, la cual presenta al menos un 85% de identidad con respecto a la longitud completa de la SEQ ID NO: 1. En una realización más preferida, el polinucleótido de la invención es SEQ ID NO: 6, secuencia nucleotídica precursora de la SEQ ID NO: 5 que comprende esta secuencia.
Otro aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5.
Otro aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6.
En otra realización preferida del primer aspecto de la invención, el polinucleótido de la invención comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 90% de identidad con respecto a la longitud completa de la secuencia SEQ ID NO: 1. En una realización más preferida, el polinucleótido de la invención comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 95% de identidad con respecto a la longitud completa de la secuencia SEQ ID NO: 1. En una realización más preferida, el polinucleótido de la invención comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 98% de identidad con respecto a la longitud completa de la secuencia SEQ ID NO: 1. En una realización más preferida, el polinucleótido de la invención comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1. En una realización aun más preferida, el polinucleótido de la invención es SEQ ID NO: 2, secuencia nucleotídica precursora de la SEQ ID NO: 1 que comprende esta secuencia.
Dentro del alcance de esta invención se encuentran también los precursores o secuencias nucleotídicas precursoras. El término “precursor” o “secuencia precursora” tal como aquí se utiliza incluye a cualquier secuencia nucleotídica que cuando se procesa mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, corte enzimático, es capaz de proporcionar un polinucleótido con al menos un 60%, preferiblemente con al menos un 65%, más preferiblemente con al menos un 70%, con al menos un 75%, con al menos un 80%, con al menos un 85%, con al menos un 90%, con al menos un 95% o con al menos un 98% de identidad con respecto a la longitud completa de la SEQ ID NO: 1, o bien que es capaz de proporcionar un polinucleótido de secuencia SEQ ID NO: 1; o que es capaz de proporcionar un polinucleótido de secuencia SEQ ID NO: 3; o que es capaz de proporcionar un polinucleótido de secuencia SEQ ID NO: 5. Ventajosamente, dicho precursor es una secuencia nucleotídica que aumenta la biodisponibilidad de los polinucleótidos que proporciona cuando se administra a un individuo o que potencia la liberación de los mismos en un compartimento biológico. Preferiblemente, las secuencias nucleotídicas precursoras de la invención son la SEQ ID NO: 2, secuencia a la que también se hará referencia como pre-miR-219a y que es precursora de la SEQ ID NO: 1; la SEQ ID NO: 4, secuencia precursora de la SEQ ID NO: 3; y la SEQ ID NO: 6, secuencia precursora de la SEQ ID NO: 5. Todas estas secuencias nucleotídicas precursoras comprenden los polinucleótidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5, respectivamente.
Los medicamentos y composiciones farmacéuticas de la invención son útiles para el tratamiento de canalopatías arritmogénicas, preferiblemente, para el tratamiento de canalopatías arritmogénicas que se deben a alteraciones en los canales de sodio, ya que el polinucleótido de la invención es capaz de reducir la expresión del gen SCN5A que codifica para una proteína transmembrana de los canales de sodio, por lo que puede ser empleado en aquellas canalopatías arritmogénicas debidas a alteraciones de ganancia de función en estos canales. El polinucleótido de la invención que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:5ºeldeSEQ ID NO: 6, presenta una menor complementariedad con el mRNA de este gen que el microRNA nativo, por lo que al competir con este último por dicha unión es capaz de incrementar los niveles de mRNAs de este gen, en comparación con el microRNA nativo, por lo que es útil para el tratamiento de canalopatías arritmogénicas debidas a alteraciones de pérdida de función en los canales de sodio.
Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere al uso del polinucleótido de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de canalopatías arritmogénicas, o alternativamente, al polinucleótido de la invención para su uso como medicamento para el tratamiento de canalopatías arritmogénicas. En una realización preferida, las canalopatías arritmogénicas se deben a alteraciones en los canales de sodio. En una realización más preferida, la canalopatía arritmogénica que se debe a alteraciones en los canales de sodio es el síndrome de QT largo tipo 3.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del polinucleótido de la invención que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 5 o del polinucleótido de la invención de secuencia SEQ ID NO: 6 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de síndrome de Brugada.
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El término “medicamento”, tal y como se usa en esta descripción, hace referencia a cualquier sustancia usada para la prevención, el diagnóstico, el alivio, el tratamiento o la curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención se refiere a una preparación que comprenda, al menos, el polinucleótido de la invención.
El polinucleótido de la invención se formula en una composición farmacéutica apropiada, en la cantidad terapéuticamente efectiva, preferiblemente junto con uno o más vehículos, adyuvantes o excipientes farmacéuticamente aceptables.
El término “tratamiento”, tal como se entiende en la presente invención, supone combatir los efectos causados como consecuencia de las canalopatías arritmogénicas, preferiblemente, de las canalopatías arritmogénicas que se deben a alteraciones en los canales de sodio, más preferiblemente del síndrome de QT largo tipo 3 o del síndrome de Brugada, para estabilizar el estado de los individuos o prevenir daños posteriores. El término “prevención”, tal como se entiende en la presente invención, consiste en evitar la aparición de daños cuya causa sean las canalopatías arritmogénicas, preferiblemente, las canalopatías arritmogénicas que se deben a alteraciones en los canales de sodio, más preferiblemente el síndrome de QT largo tipo3ºel síndrome de Brugada.
Se entiende por “canalopatía arritmogénica” cualquier cardiomiopatía (o alteración de la función del miocardio) genética que resulta de mutaciones en los genes responsables del correcto funcionamiento de los canales iónicos que generan el potencial de acción transmembrana, lo cual conlleva defectos en la función (ganancia o pérdida) de dichos canales, alteraciones fisiológicas de la duración del potencial de acción transmembrana y/o predisposición a desarrollar arritmias ventriculares en ausencia de cardiopatía estructural. Ejemplos de canalopatías arritmogénicas incluyen, aunque sin limitarnos, síndrome de Brugada, síndrome de QT largo, síndrome de QT corto o taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica. Las canalopatías arritmogénicas pueden ser diagnosticadas, por ejemplo, aunque sin limitarnos, como se describe en Cabrera Ortega M., et al., 2009, Revista Cubana Pediatría, 81 (4) .
Las “canalopatías arritmogénicas que se deben a alteraciones en los canales de sodio” son aquellas canalopatías cuya base genética se encuentra en mutaciones (de pérdida o de ganancia de función) en al menos uno de los genes que codifican para dichos canales, preferiblemente, en el gen SCN5A de SEQ ID NO: 7. La detección de este tipo de canalopatías se puede realizar mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, un electrocardiograma, mediante el cual es posible hacer un diagnóstico potencial de las corrientes alteradas (Antzelevitch et al., 2005a, 2005b, Circulation, 111:659-670) ; o bien mediante PCR de los genes que codifican para los canales de sodio, preferiblemente del gen SCN5A, y posterior secuenciación, lo cual permite detectar alteraciones en el gen que puedan ser las causantes de la canalopatía (Ashley & Niebauer, 2004, J. Cardiology explained; Kapplinger et al., 2010, Heart Rhythm, 7 (1) :33-46) .
El “síndrome de QT largo tipo 3” o “LQT3” se caracteriza por una alteración en la repolarización ventricular traducida en el electrocardiograma por un alargamiento en el intervalo QT corregido (QTc) por fórmula de Bazzet
√
(QTc=QT/ R) ≥ 440 ms, que predispone a arritmia de puntas torcidas (torsade de pointe) y muerte súbita. Puede diagnosticarse, por tanto, mediante por ejemplo, aunque sin limitarnos, electrocardiograma o registro Holter. Otros criterios diagnósticos de este síndrome son el síncope inducido por estrés y/o alternancia eléctrica de la onda T. Este síndrome se debe a mutaciones en el gen SCN5A que originan anomalías en el canal de sodio. Este gen se localiza en el brazo corto del cromosoma 3 (3p21-24) .
El “síndrome de Brugada” se caracteriza por la probabilidad de presentar episodios sincopales o parada cardíaca causados por taquicardia ventricular polimórfica o fibrilación ventricular durante el reposo o el sueño, con un patrón electrocardiográfico de aparente bloqueo de rama derecha y supradesnivel del segmento ST que cae con lentitud y finaliza en una onda T negativa en V1, V2 y V3, sin depresión de las derivaciones opuestas. Genéticamente se han identificado siete tipos de síndrome de Brugada, los más frecuentes son, aunque sin limitarnos, síndrome de Brugada de tipo 1 o síndrome de Brugada de tipo 2.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica, de ahora en adelante, “primera composición farmacéutica de la invención”, que comprende el polinucleótido de la invención que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos un 60%, preferiblemente con al menos un 65%, más preferiblemente con al menos un 70%, con al menos un 75%, con al menos un 80%, con al menos un 85%, con al menos un 90%, con al menos un 95% o con al menos un 98% de identidad con respecto a la longitud completa de la secuencia SEQ ID NO: 1, o que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1, o de SEQ ID NO: 2, o que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:3ºdeSEQ ID NO: 4.
En una realización preferida, la primera composición farmacéutica de la invención además comprende otro principio activo. En una realización más preferida, la primera composición farmacéutica de la invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica, de ahora en adelante, “segunda composición farmacéutica de la invención”, que comprende el polinucleótido de la invención que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:5ºdeSEQ ID NO: 6.
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En una realización preferida, la segunda composición farmacéutica de la invención además comprende otro principio activo. En una realización más preferida, la segunda composición farmacéutica de la invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Como se emplea aquí, el término “principio activo”, “sustancia activa”, “sustancia farmacéuticamente activa”, “ingrediente activo” ó “ingrediente farmacéuticamente activo” significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.
Los “adyuvantes” y “vehículos farmacéuticamente aceptables” se refieren a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluyen, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en la presente invención son los vehículos conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, los residuos lipídicos.
Las composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención pueden utilizarse en un método de tratamiento o de prevención de forma aislada o conjuntamente con otros compuestos farmacéuticos destinados al tratamiento o prevención de las canalopatías arritmogénicas, preferiblemente, de las canalopatías arritmogénicas que se deben a alteraciones en los canales de sodio, más preferiblemente, de síndrome de QT largo tipo3ºde síndrome de Brugada.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse para su administración en una variedad de formas conocidas en el estado de la técnica.
Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, intraarticular, intrasinovial, intralesional, intraarterial, intracardíaca, intramuscular, intranasal, subcutánea, intracapsular, tópica, mediante parches transdérmicos, mediante administración percutánea, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna, bomba de infusión o vía catéter.
La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia del individuo. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a la cantidad de las composiciones farmacéuticas de la invención que produzca el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichas composiciones farmacéuticas y el efecto terapéutico a conseguir.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la primera y de la segunda composición farmacéutica de la invención para la elaboración de un medicamento, o alternativamente, a la primera y segunda composición farmacéutica de la invención para su uso como medicamento. En una realización preferida, el medicamento es para el tratamiento de canalopatías arritmogénicas. En una realización más preferida, las canalopatías arritmogénicas se deben a alteraciones en los canales de sodio. En una realización aun más preferida, la canalopatía arritmogénica que se debe a alteraciones en los canales de sodio es el síndrome de QT largo tipo 3.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la segunda composición farmacéutica de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de síndrome de Brugada, o alternativamente, a la segunda composición farmacéutica de la invención para su uso como medicamento para el tratamiento de síndrome de Brugada.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos o componentes. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Descripción de las figuras
Fig. 1. Muestra el esquema de complementariedad del hsa-mir-219-5p (SEQ ID NO: 1) con la región 3’UTR del mensajero del gen SCN5A. Secuencia superior: región 3’UTR del mensajero del gen SCN5A (posición 1.416-1.422, 5’-3’) . Secuencia inferior: secuencia del hsa-mir-219-5p (SEQ ID NO: 1, 3’-5’) con la secuencia complementaria al mensajero del gen SCN5A (GAUUGUC) marcada en blanco. Barras negras: nucleótidos complementarios.
Fig. 2. Muestra la secuencia del hsa-mir-219-5p maduro y de su precursor. A. Muestra la secuencia del hsa-mir219-5p maduro (SEQ ID NO: 1) . En negrita se destaca la secuencia que presenta complementariedad con la región 3’UTR del mensajero del gen SCN5A, es decir, la secuencia GAUUGUC. B. Muestra la secuencia del pre-miR-219a (SEQ ID NO: 2) . En negrita se destaca la región correspondiente al hsa-mir-219-5p maduro (SEQ ID NO: 1) . C. Muestra el esquema de la estructura en horquilla del pre-miR-219a. En gris se destaca la secuencia madura del hsamir-219-5p (SEQ ID NO: 1) en las dos hebras complementarias del pre-miR-219a (SEQ ID NO: 2) .
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Fig. 3. Muestra el análisis por qRT-PCR de la expresión del gen SCN5A en células miocárdicas atriales (HL-1) 6 horas tras la transfección con el hsa-mir-21 9-5p de SEQ ID NO: 1. Barras negras: células control, donde no se transfectó el hsa-mir-219-5p. Barras blancas: células donde se transfectó el hsa-mir-219-5p.
Fig. 4. Muestra los resultados de los ensayos inmunohistoquímicos contra el producto de expresión del gen SCN5A en células control (panel izquierdo) y en células a las que se les transfectó el hsa-mir-219-5p (panel derecho) . El panel izquierdo muestra la expresión proteica normal de Nav1.5 (SCN5A) en la célula cardiomiocítica. Tras la transfección con miR-219-5p (panel derecho) Nav1.5 parece quedar secuestrado en el aparato de Golgi, y por tanto está muy poco representado en la membrana citoplasmática, donde normalmente ejerce su función de transporte de iones sodio.
Fig. 5. Muestra un esquema ilustrativo de la estrategia para el tratamiento de síndrome de QT largo tipo 3 donde hay ganancia de función del gen SCN5A. A. Secuencia superior: región 3’UTR del mensajero del gen SCN5A (posición 1.416-1.422, 5’-3’) . Secuencia inferior: secuencia del hsa-mir-219-5p (SEQ ID NO: 1, 3’-5’) con la secuencia complementaria al mensajero del gen SCN5A (GAUUGUC) marcada en blanco. El recuadro de la secuencia inferior muestra los tres nucleótidos que se han sustituido por los nucleótidos que se muestran en la parte inferior para dar lugar a la SEQ ID NO: 3. Se muestra la complementariedad entre ambas secuencias, superior e inferior (barras) . Las barras grises representan los nuevos sitios complementarios creados para dar lugar a la SEQ ID NO: 3. B. Muestra la secuencia del precursor de la SEQ ID NO: 1, pre-miR-219a, de SEQ ID NO: 2, donde se destaca en gris la secuencia madura del hsa-mir-219-5p (SEQ ID NO: 1) en las dos hebras complementarias del pre-miR-219a, en un recuadro se señalan los tres nucleótidos modificados para diseñar la SEQ ID NO: 3. C. Muestra la SEQ ID NO: 3 (en negrita) comprendida en su secuencia precursora o SEQ ID NO: 4. En gris se destacan los nucleótidos modificados.
Fig. 6. Muestra un esquema ilustrativo de la estrategia para el tratamiento de síndrome de Brugada donde hay pérdida de función del gen SCN5A. A. Secuencia superior: región 3’UTR del mensajero del gen SCN5A (posición 1.416-1.422, 5’-3’) . Secuencia inferior: secuencia del hsa-mir-219-5p (SEQ ID NO: 1, 3’-5’) con la secuencia complementaria al mensajero del gen SCN5A (GAUUGUC) marcada en blanco. Los recuadros de la secuencia inferior muestran los tres nucleótidos que se han sustituido por los nucleótidos que se muestran en la parte inferior para dar lugar a la SEQ ID NO: 5. Se muestra la complementariedad entre ambas secuencias, superior e inferior (barras) . B. Muestra la secuencia del precursor de la SEQ ID NO: 1 pre-miR-219a, de SEQ ID NO: 2, donde se destaca en gris la secuencia madura del hsa-mir-219-5p (SEQ ID NO: 1) en las dos hebras complementarias del pre-miR-219a, en un recuadro se señalan los tres nucleótidos modificados para diseñar la SEQ ID NO: 5. C. Muestra la SEQ ID NO: 5 (en negrita) comprendida en su secuencia precursora o SEQ ID NO: 6. En gris se destacan los nucleótidos modificados.
Fig. 7. Muestra la expresión del gen SCN5A en células miocárdicas atriales (HL-1) transfectadas con la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6 durante 12 horas. Células control (wt) , donde se transfectó el precursor de hsa-mir-219-5p o miR-219a endógeno (SEQ ID NO: 2) . miR-219a-: Células transfectadas con el precursor de miR-219a- (SEQ ID NO: 4) , diseñado para tratar canalopatías arritmogénicas debidas a una ganancia de función en el gen SCN5A. miR-219a+: Células transfectadas con el precursor de miR-219+ (SEQ ID NO: 6) , diseñado para tratar canalopatías arritmogénicas debidas a una pérdida de función en el gen SCN5A. La figura muestra que las células HL1 transfectadas con la SEQ ID NO: 4 muestran una disminución en la expresión de SCN5A en comparación con las células transfectadas con el precursor endógeno de miR-219a (SEQ ID NO: 2) , mientras que las células miocárdicas transfectadas con la SEQ ID NO: 6 muestran incremento en la expresión de SCN5A en comparación con las células transfectadas con el precursor endógeno de miR-219a (SEQ ID NO: 2) .
Ejemplos
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y la efectividad de las secuencias polinucleotídicas de la invención en la modulación de la función del gen SCN5A. Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
Ejemplo 1
Efecto de la expresión de hsa-mir-219-5p en la expresión del gen SCN5A en células miocárdicas atriales
El hsa-mir-219-5p (SEQ ID NO: 1) es capaz de unirse a la región 3’UTR del mRNA del gen SCN5A como se muestra en la figura 1, en concreto mediante la región correspondiente a la secuencia GAUUGUC incluida en la SEQ ID NO: 1 (marcada en negrita en la figura 2A) . Este hsa-mir-219-5p se encuentra incluido en la secuencia de su precursor o pre-miR-219a (SEQ ID NO: 2) como se observa en las figuras 2B y 2C.
En la presente invención, se exploró in vitro el efecto de la sobreexpresión de hsa-mir-219-5p en la actividad del gen Scn5a. Para ello se transfectaron células miocárdicas atriales (HL-1) con hsa-mir-219-5p, y se valoraron los niveles
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de expresión del gen SCN5A en las mismas mediante qRT-PCR. El análisis de la expresión de SCN5A a 6 h posttransfección y normalizado con dos controles internos distintos (beta-actina y gapdh) mostró una severa disminución de la expresión del canal de sodio mediada por SCN5A (Figura 3) .
Para constatar estos datos de forma independiente, se realizaron también ensayos inmunohistoquímicos contra el producto de expresión de SCN5A, en los cuales se observó que existía un cambio sustancial en la localización del canal de sodio codificado por SCN5A tras la transfección con hsa-mir-219-5p. En las células control, la localización del producto de expresión de SCN5A era principalmente citoplasmática y, de forma global, se encontraba localizado en la membrana plasmática, mientras que en las células transfectadas con hsa-mir-219-5p, el canal de sodio se encontraba retenido en el retículo endoplasmático y/o aparato de Golgi, y la localización citoplasmática y/o de membrana celular se encontraba seriamente disminuida (Figura 4) . Por tanto, estos datos estaban en consonancia con los datos obtenidos mediante qRT-PCR.
Finalmente se evaluó si la transfección de hsa-mir-219-5p condicionaba la capacidad contráctil de los cardiomiocitos en cultivo. De este modo, se contaron las contracciones de los cardiomiocitos controles y de los cardiomiocitos transfectados con hsa-mir-219-5p, y se observó que el ritmo estaba disminuido en un 30% aproximadamente en estos últimos, y que el patrón de contracción era asincrónico (Tabla 1) . Por tanto, estos datos revelaron que hsa-mir-219-5p puede regular la función del canal de sodio, lo cual es muy importante puesto que supone un mecanismo molecular de fácil manipulación y alta accesibilidad que permite corregir la falta o ganancia de función del canal de sodio cardíaco que subyace a síndromes arritmogénicos como Brugada o QT largo, respectivamente.
TABLA 1
Capacidad contráctil de las células miocárdicas atriales (HL-1) control y transfectadas con hsa-mir-219-5p
Ejemplo 2
Efecto de la expresión de los hsa-mir-219-5p modificados de SEQ ID NO:3y deSEQ ID NO: 5enlaexpresión del gen SCN5A en células miocárdicas atriales
Respecto a la generación de los microRNAs modificados, de SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5, se modificó parcialmente la estructura primaria del precursor pre-miR-219a (figuras 5 y 6) , para incrementar o disminuir, respectivamente, su capacidad de unión al RNA mensajero de SCN5A respecto al hsa-mir-219-5p, y de esta forma aumentar (en pacientes con síndrome de Brugada) o disminuir (en pacientes con síndrome de QT largo tipo 3) la función del canal de sodio cardíaco.
2.1. Polinucleótido para el tratamiento de síndrome de QT largo tipo 3
Se modificaron tres nucleótidos en el pre-miR-219a nativo de acuerdo con la secuencia de la región 3’UTR del mensajero del gen SCN5A, como se muestra en la figura 5A, 5B y 5C, diseñándose así una hebra madura que tenía 12 sitios de unión complementarios al mRNA diana en lugar de los 9 nativos. Por tanto, el precursor de este microRNA, de SEQ ID NO: 4, así diseñado incrementó la eficacia en la reducción de la expresión del gen SCN5A (Figura 7) .
2.2. Polinucleótido para el tratamiento de síndrome de Brugada
Por otro lado, se modificaron tres nucleótidos comprendidos en la secuencia GAUUGUC del hsa-mir-219-5p contenido en el precursor pre-miR-219a de acuerdo con la secuencia de la región 3’UTR del mensajero del gen SCN5A, como se muestra en la figura 6A, 6B y 6C, diseñándose así una hebra madura que tenía únicamente 6 sitios de unión complementarios, y además dispersos, al mRNA diana en lugar de los 9 nativos. Por tanto, el precursor de este microRNA, de SEQ ID NO: 6, así diseñado incrementó la expresión del gen SCN5A respecto al microRNA-219a nativo (Figura 7) .
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