Uso de catecolamina para la diferenciación de células madre a cardiomiocitos.
La presente invención se refiere al uso de catecolamina para la diferenciación de células madre a cardiomiocitos así como un método para la obtención de estas células cardíacas. Además, la catecolamina puede usarse para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un daño cardíaco.
Estado de la técnica anterior
Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de mortalidad en los países desarrollados, con 32% de las causas de muerte en España (Instituto Nacional de Estadística) y 2 millones anuales en la Unión Europea (Estadísticas de enfermedad cardiovascular 2008) . Por otro lado, el 1% de los niños nacidos en nuestro país presenta alguna enfermedad congénita cardíaca. La alteración de un único gen tiene graves implicaciones en el desarrollo del corazón, así mutaciones en GATA4, son la causa de defectos en la septación de aurícula y ventrículo (Garg et al. 2003. Nature, 424: 443-447) , mutaciones en NKX2.5 además de los defectos citados en el caso de GATA4 también tiene defectos en la conducción eléctrica (Schott et al., (1998) . Science, 281: 108-111) . Mutaciones en TBX5 son las causantes del Síndrome de Holt-Oram, el cual tiene unos defectos similares a las mutaciones en NKX2.5 (Srivastava, 2006. Cell 126: 1037-1048) .
La potencialidad de las células madre embrionarias en medicina regenerativa para la reparación y regeneración de tejidos y órganos vitales se ha puesto de manifiesto a lo largo de la última década (Narayan et al., 2006. Blood, 107: 2180-2183; Klug et al., 1996. J Clin Invest. 98: 216-224; Laflame et al., 2005. Nat Biotechnol. 23: 845-856; Ben-Hur y cols., 2004. Stem Cells 22: 1246-1255; Keirstad y cols., 2005. J Neurosci. 25, 4694-4705; Jiang et al., 2007. Cell Res. 17: 333-344) . El atractivo de estas células radica en la capacidad de diferenciarse a cualquier tipo celular. Sin embargo, la implantación de las mismas en condiciones indiferenciadas en corazones infartados (Laflamme y Murr y , 2005. Nat Biotechnol. 23: 845-856) han reportado resultados inesperados como la aparición de teratomas. Se ha propuesto que un paso de diferenciación in Vitro entre células pluripotentes y cardiomiocitos diferenciados, evitaría estos efectos adversos (Laflamme et al., 2007. Am J Pathol, 167: 663-671; Caspi et al. 2007. J Am Coll Cardiol, 50: 1884-1893) .
Desde la primera vez que se aislaron las células madre de embriones preimplantados de ratón (Evans y Kaufman, 1981. Nature. 292: 154-156) , se han establecido diversas líneas de células madre aunque no con todas se ha conseguido diferenciación a cardiomiocitos. El protocolo de diferenciación de las células madre embrionarias hacia un linaje cardíaco (Boeler et al., 2002. Circ Res. 91: 189-201) , pasa por la formación de estructuras tridimensionales, denominadas cuerpos embrionarios (EB) , en los cuales se encuentran representadas los tres linajes embrionarios: ectodermo, endodermo y mesodermo. Las células cardiacas, de origen mesodérmico, se sitúan en el EB entre una capa superficial epitelial y una capa basal de células mesenquimales (Hescheler et al., 1997. Cardiovasc Res. 36: 149-162) . Dentro del EB, coexisten diferentes grados de diferenciación de cardiomiocitos. De esta forma, los cardiomiocitos menos diferenciados tendrían una forma redondeada, con miofibrillas desorganizadas y sus características serían similares a las células que constituyen el marcapasos del corazón. Los más diferenciados, tienen características similares a cardiomiocitos auriculares y ventriculares, y poseen miofibrillas altamente organizadas, observándose de forma definida las bandas Z, A e I que caracterizan a las sarcómeras de los miocardiocitos maduros (Hescheler et al., 1997. Cardiovasc Res, 36: 149-162) .
Uno de los problemas que surge en la diferenciación de células madre es el reducido número de cardiomiocitos obtenidos, siendo del 1-3% en el caso de células madre embrionarias de ratón, e inferiores al 1% en el caso de las humanas (Murr y y Keller, 2008. Cell, 132: 661-680) . Ésto supone un inconveniente a la hora de utilizar dichas células para tratamiento clínico de enfermedades cardíacas, si tenemos en cuenta que un infarto de miocardio puede llegar a matar hasta tres mil millones de las aproximadamente ocho mil quinientos millones de células que componen un corazón adulto (Sánchez y García-Sancho, 2007. Cell Death Differ. 14:1258-1261) . Por tanto, la mejora en la eficiencia de diferenciación cardiaca supondría un gran avance en el éxito de la terapia regenerativa para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.
Además de las células madre embrionarias se ha propuesto que el propio corazón adulto puede ser una fuente de precursores cardiacos con capacidad de diferenciación, y por tanto con potencial uso en medicina regenerativa.
A lo largo de la historia se ha pensado que las células del corazón adulto, al igual que las del cerebro no tenían capacidad de renovación. Sin embargo, mediante ensayos de proliferación y muerte celular se ha visto que en corazón de ratón el porcentaje diario de las células que se mueren es el mismo al de las células que proliferan (Sánchez y García-Sancho, 2007. Cell Death Differ, 14: 1258-1261) . Esto supondría que las células del corazón adulto de ratón se renuevan por completo cada año, (Sánchez y García-Sancho, 2005. Stem Cell Therapy and Tissue Engineering for Cardiovascular Repair. Springer: New York, pp 121-134) y las del corazón adulto humano cada 5 años (Anversa et al., 2006. Circulation. 113: 1451-1463) . Diferentes poblaciones de progenitores cardíacos se han descrito. Así Urbanek et al., 2006 describieron poblaciones de células con capacidad proliferativa ubicadas en nichos en el corazón, que se concentraban en la región auricular. Beltrami et al., 2003, aislaron una población de progenitores cardíacos de rata adulta que expresan c-kit. Tras expandir esta población In Vitro y posterior inyección en corazón con isquemia aguda consiguieron diferenciación a células de músculo liso, endotelio vascular y cardiomiocitos. También se han descrito otras poblaciones de progenitores cardíacos que expresan genes como Sca-1, (Oh et al., 2007. PNAS, 100: 12313-12318) , o islet-1, (Cai et al., 2003. Dev Cell. 5: 877-889) . Estas últimas crecen en condiciones indiferenciadas in Vitro, pero se diferencian a cardiomiocitos cuando son cultivadas en presencia de los cardiomiocitos diferenciados (Laugwitz et al., 2005. Nature. 433: 647-653) .
A pesar de que estos progenitores presentes en corazones adultos proliferan y se diferencian en condiciones fisiológicas y cuando son cultivados in Vitro, no tienen capacidad de regeneración autónoma del parénquima cardíaco después de un daño cardiaco (Sánchez y García-Sancho, 2007. Cell Death Differ. 14: 1258-1261) . Por tanto, tratamientos que estimulen las propiedades de proliferación y diferenciación de éstos precursores podrían estimular el potencial regenerativo del tejido cardiaco.
En este sentido, en la presente invención se presenta una solución al problema de la diferenciación de células madre a cardiomiocitos.
Explicación de la invención
En la presente invención se demuestra cómo las catecolaminas son capaces de inducir la diferenciación de varias líneas de células madre embrionarias de ratón a cardiomiocitos. Además, se han realizado estudios de la expresión de la enzima tirosina hidroxilasa (TH) , primera enzima y paso limitante en la ruta de síntesis de las catecolaminas, detectándose ésta desde estadios previos al establecimiento de conexiones nerviosas en el embrión de pollo. Por tanto, la detección de la expresión de la TH en una región conocida como Hfr (del inglés Heart forming region, que corresponde a las células que van a formar el tubo cardiaco) en el embrión de pollo en gastrulación indica que el producto de esta reacción mediada por la TH, es decir, las catecolaminas, están implicadas en el desarrollo cardíaco mediante la diferenciación de células madre o progenitores cardiacos a cardiomiocitos.
En esta invención se demuestra que la L-DOPA y la dopamina inducen la expresión de proteínas contráctiles cardíacas como AMHC (miosina auricular de cadena pesada) , VMHC (miosina ventricular de cadena pesada) , y de factores de transcripción implicados en desarrollo cardiaco.
Las células madre embrionarias tienen un alto potencial en la medicina regenerativa porque son capaces, con las señales adecuadas, de diferenciarse a cualquier tipo celular, incluyendo cardiomiocitos. La aplicación de estas células en enfermedades cardiovasculares está siendo dificultada por la mezcla de poblaciones celulares que se originan en su diferenciación.
En este sentido, un primer aspecto de la presente invención consiste en el uso de catecolamina para la diferenciación de células madre a cardiomiocitos. En esta memoria el término diferenciación incluye la maduración de los progenitores cardiacos generados. Estos precursores incluyen tanto aquellos que son generados con el uso de catecolaminas como con cualquier otro método in vitro así como los que se generan de forma natural in vivo.
Las catecolaminas son un grupo de sustancias que incluye la dopamina, noradrenalina o adrenalina. En esta memoria, el precursor de dopamina, L-DOPA, se incluye como parte de este grupo a efectos de unificar la referencia a su acción de diferenciación. Las 3 catecolaminas citadas tienen la estructura distintiva de un anillo de benceno, con dos grupos hidroxilos, una cadena intermedia y un grupo amino terminal, a esta estructura se le llama catecol y es lo que da nombre a la familia.
Las catecolaminas se producen principalmente en las células cromafines de la médula adrenal y en las fibras postganglionares del sistema nervioso simpático. La tirosina hidroxilasa se encuentra en todas las células que sintetizan catecolaminas. La TH es una oxidasa de acción combinada que usa el oxígeno molecular y tirosina como sustratos y biopterina como cofactor. Cataliza la adición de un grupo hidroxilo a la meta posición de la tirosina, formando de esta manera 3, 4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA) . La siguiente reacción está catalizada por la aminoácido aromático descarboxilasa, que pasa L-DOPA a dopamina. Necesita piridoxal fosfato. El paso de dopamina a noradrenalina es catalizado por la dopamina β-hidroxilasa, a partir de ascorbato y oxígeno. Por último, para que la noradrenalina pase a adrenalina se usa feniletanolamina N-metiltransferasa, que transfiere un grupo metilo de un donador (S-adonosilmetionina) hasta la adrenalina formante.
En este sentido, una sobreexpresión de la enzima TH o su aplicación exógena a células madre o células precursoras cardiacas favorecería la diferenciación de células madre a cardiomiocitos ya que los productos de su acción enzimática, L-DOPA de forma directa y dopamina de forma indirecta, están implicados, tal como se demuestra en esta invención, en la citada diferenciación. Asimismo, el uso de agonistas de la TH podría producir el mismo efecto de diferenciación de células madre a cardiomiocitos.
El término "cardiomiocito" se refiere a células del miocardio o músculo cardíaco capaces de contraerse de forma espontánea e individual.
Los cardiomiocitos pueden ser generados a partir de diferentes tipos celulares, entre los que se encuentran: células madre embrionarias, células mononucleares seleccionadas a partir de extracción de médula ósea o de sangre, sin excluir cualquier otro tipo de célula indiferenciada, células progenitoras cardíacas y células musculares esqueléticas.
En esta invención una célula madre es una célula indiferenciada que, mediante una división asimétrica, da lugar a una célula hija que continúa dividiéndose, manteniendo la característica de renovación, y a otra célula hija que continúa la vía de diferenciación para la que está programada y, por lo tanto, puede producir uno o más tejidos maduros, funcionales y plenamente diferenciados. Dentro de las células madre se pueden distinguir diferentes categorías según su origen y grado de potencialidad. Así, están las células madre totipotentes (puede crecer y formar un organismo completo) , las células madre pluripotentes (puede formar cualquier tipo de célula proveniente de los tres linajes embrionarios; endodermo, ectodermo y mesodermo) , las células madre multipotentes (solo pueden generar células de su propia capa o linaje embrionario de origen) , o células precursoras (pueden formar únicamente un tipo de célula particular) . Las células madre embrionarias son del tipo de células madre pluripotentes, forman parte de la masa celular interna de un embrión de pocos días de edad y tienen la capacidad de formar todos los tipos celulares de un organismo adulto.
Como se ha citado anteriormente, en esta memoria, el término diferenciación incluye el proceso de maduración de los cardiomiocitos. La maduración está caracterizada por la adquisición de proteínas contráctiles como actina, miosina, troponina y tropomiosina, que forman la unidad estructural del cardiomiocito funcional, el sarcómero, y les confieren la capacidad de contracción autónoma. En la presente invención se demuestra cómo el precursor de catecolaminas, L-DOPA, desempeña un papel importante en la maduración de los cardiomiocitos, dado que produce un aumento en la expresión de algunas de las proteínas contráctiles. Para demostrar este importante papel en su maduración, se realiza una RT-PCR cuantitativa utilizando el ARN de células cuyo tratamiento se llevó a cabo una vez las células de los cuerpos embrionarios ya habían empezado a latir. Se emplearon los cebadores correspondientes a proteínas contráctiles y se observó, tal como se indica en el ejemplo 7, un aumento significativo de las miosinas de cadena pesada (β-MHC y α MHC) así como de cadena ligera (MLC2A y MLC2V) , y también de la actina cardiaca (α-actina) y la troponina cadiaca T2. Tal como se explica más claramente en la parte final de este apartado, (explicación de la invención) , estas proteínas están relacionadas directamente con la formación de cardiomiocitos y con su maduración.
Una posible aplicación de estos cardiomiocitos es su transplante para la compensación de una pérdida de células cardíacas, después de un evento isquémico o degenerativo. El transplante de cardiomiocitos inmaduros puede tener efectos secundarios indeseados tales como las arritmias.
En una realización preferida, la catecolamina se selecciona del grupo que comprende: L-DOPA, dopamina, cualquiera de sus sales, análogos o cualquier combinación de las anteriores.
Por "sales" de catecolamina se entienden las sales de ácidos orgánicos o inorgánicos, principalmente sales de ácido clorhídrico o de bitartrato, sin limitarse a estas en exclusiva.
El término "análogos" se refiere a productos químicos con una estrecha relación estructural con el compuesto original, catecolamina. Comprende compuestos que se parecen estructuralmente a los compuestos naturales, pero se han reemplazado uno o más átomos en la estructura por otros. Estos análogos mantienen la misma función que la catecolamina original.
En otra realización preferida, las células madre embrionarias pertenecen a ratón.
En varias realizaciones preferidas de la anterior realización, las células madre embrionarias pertenecen a la línea celular E14 (E14Tg2a.IV) o a la línea celular HM1, ambas líneas celulares son de ratón.
Otro aspecto de la presente invención es el uso de catecolamina para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un daño cardíaco mediante la diferenciación de células progenitoras cardíacas a cardiomiocitos.
Las células progenitoras cardíacas presentes en corazones adultos proliferan y se diferencian en condiciones fisiológicas y cuando son cultivadas in vitro pero, no tienen capacidad de regeneración autónoma del parénquima cardíaco después de un daño cardiaco. Con esta invención se estimulan las propiedades de proliferación y diferenciación de éstos precursores que favorecen la regeneración del tejido cardiaco.
Se entiende por daño cardíaco la afección de la funcionalidad de las células del músculo cardíaco en su capacidad de contracción y regeneración motivadas ambas por la diabetes, la obesidad, el estrés, el tabaquismo, la hipertensión, factores hereditarios, condiciones ambientales extremas, interrupción en el riego sanguíneo arterial, u otros factores no mencionados.
El tratamiento del daño cardíaco referido en este aspecto de la invención se lleva a cabo mediante la administración de un medicamento que contiene en su composición, al menos, catecolamina, para favorecer la diferenciación de células progenitoras cardíacas a cardiomiocitos.
El siguiente aspecto de la presente invención es un método para la diferenciación de células madre a cardiomiocitos que comprende:
a. cultivar una línea de células madre en un medio de cultivo de diferenciación.
El medio de diferenciación es un medio de crecimiento suplementado con compuestos de diversa naturaleza que permiten la diferenciación de las células madre. Este medio de diferenciación puede estar compuesto por medio de crecimiento (por ejemplo, DMEM, Dulbecco's Modified Eagle Medium) , L-glutamina, piruvato, glucosa, suero de uso regular, glutamina, aminoácidos no esenciales y 2-mercaptoetanol (tal como se especifica en el ejemplo 2.1.1) . También puede estar compuesto del medio de crecimiento suplementado con 3-isobutil-1-metilxantina, dexametasona e insulina. Otros ejemplos de medios de diferenciación son medio MEM (Modified Eagle Medium) con el suplemento B-27 (Gibco-BRL) y, el medio consistente en la mezcla a partes iguales de F12 (Gibco-BRL) y MEM (Gibco-BRL) , suplementado con insulina, transferrina, putrescina, progesterona, selenio, glucosa y albúmina bovina sérica (BSA) . Los medios de diferenciación citados en este apartado no limitan el uso de medios con otras composiciones que puedan ser utilizadas para llevar a cabo este método de diferenciación de células madre a cardiomiocitos.
b. adicionar catecolamina al medio de diferenciación en el que se encuentran las células del paso anterior (a) .
En esta invención se consigue aumentar la diferenciación de células madre en células cardíacas por medio de la adición de catecolamina al medio de diferenciación descrito en el paso anterior.
c. renovar periódicamente el medio de cultivo de diferenciación con catecolamina, definido en el paso anterior (b) ,
El término "periódicamente" hace referencia a un periodo definido por el tiempo máximo que el medio de diferenciación con la catecolamina o catecolaminas mantiene las propiedades físico-químicas de cada uno de los componentes incluida la catecolamina, que permiten la diferenciación de las células madre en cardiomiocitos.
d. recolectar los cardiomiocitos generados en el paso (c) .
Los cardiomiocitos generados por medio de este método podrían ser usados en el campo de la medicina regenerativa. La medicina regenerativa permite reparar los tejidos dañados utilizando mecanismos análogos a los que de forma natural usa el organismo para la renovación de las poblaciones celulares. Los mecanismos que posee el organismo de regeneración, reparación y renovación de tejidos son limitados. De esta manera, la muerte de grandes cantidades de tejido de manera aguda (por ejemplo en los infartos de miocardio) , no son susceptibles de ser reparados por los mecanismos naturales del organismo. Las nuevas terapias de trasplante desarrolladas en los últimos años permitirán trasplantar las células cardíacas o cardiomiocitos que se generen por medio de los métodos recogidos en esta invención, lo que supondría la posibilidad para el tratamiento de este tipo de daño cardíaco.
En una realización preferida, las células madre del método anterior son células madre embrionarias. En este caso, el método comprende los siguientes pasos:
a. cultivar una línea celular en un medio de cultivo de diferenciación para obtener cuerpos embrionarios,
El término "cuerpos embrionarios" hace referencia a una estructura esferoidal que forman espontáneamente las células madre cuando se cultivan en suspensión, técnica denominada de gota colgante, que se menciona en el ejemplo 1 de la presente invención. Esta técnica impide la adhesión de las células a la placa y permite que se agreguen entre sí.
b. recolectar los cuerpos embrionarios obtenidos en el paso anterior (a) .
La recolección de los cuerpos embrionarios contenidos en las gotas colgantes, según el ejemplo 2 de la presente invención, puede realizarse por ejemplo con una pipeta y, a continuación se depositan en un pocillo de una placa para realizar el tratamiento del paso (c) .
c. adicionar catecolamina al medio de diferenciación donde se encuentran los cuerpos embrionarios obtenidos en el paso anterior (b) ,
d. renovar periódicamente el medio de cultivo de diferenciación con catecolamina, definido en el paso anterior (b) ,
e. recolectar los cardiomiocitos generados en (d) .
Los cardiomiocitos generados por este método, tal como se ha mencionado en un párrafo precedente podrían ser usados en el campo de la medicina regenerativa.
En otras realizaciones preferidas, en el método de diferenciación se emplean células madre embrionarias pertenecientes a la línea celular E14 (E14Tg2a.IV) o de la línea celular HM1, ambas líneas celulares de ratón.
Otra realización preferida hace referencia a un método donde la catecolamina se selecciona del grupo que comprende: L-DOPA, dopamina, cualquiera de sus sales, análogos o cualquier combinación de las anteriores.
Según otra realización preferida, la concentración de L-DOPA y/o dopamina adicionada en el medio de diferenciación donde se encuentran los cuerpos embrionarios es de entre 1 y 50 μM.
En una realización más preferida, la concentración de L-DOPA y/o dopamina es de entre 5 y 25 μM.
La adición de catecolamina a un medio de cultivo, medio de diferenciación definido anteriormente, conteniendo células madre, produce un aumento en la expresión de marcadores cardíacos. Se entienden por marcadores cardíacos; factores de transcripción y proteínas contráctiles.
Tal como se describe en los ejemplos de esta invención, esta inducción de factores de transcripción y proteínas contráctiles, se produce por la adición de L-DOPA y/o dopamina a un medio de cultivo en el que se diferencian células madre embrionarias, en el caso de las células embrionarias de ratón E14, se observó un aumento de los factores de transcripción NKX2.5, GATA4, TBX5, TBX2. La especificación del linaje cardiaco a partir de precursores de origen mesodérmico se produce por la expresión de un conjunto de factores de transcripción (NKX2.5, MEF2, GATA, TBX y HAD) conservados a lo largo de la evolución. Estos factores de transcripción controlan el destino de los precursores cardiacos, la expresión de proteínas contráctiles y la morfogénesis de estructuras cardiacas. Su importancia se ha puesto de manifiesto por la implicación de mutaciones en estos genes en la aparición de defectos cardiacos como se describe en el apartado de Estado de la técnica anterior.
La adición de L-DOPA o dopamina a los cuerpos embrionarios también dio lugar a un aumento en los niveles de expresión de las proteínas contráctiles miosina alfa de cadena pesada (α MHC) así como de la troponina cardiaca T2 (TT2) .
En el caso de células embrionarias de ratón de la línea HM1 que ya habían comenzado a latir, se observó un aumento del factor de transcripción TBX5 y de las miosinas de cadena pesada (β-MHC y α MHC) , así como de cadena ligera (MLC2A y MLC2V) , y también de la actina cardiaca (α-actina) y la troponina cardiaca T2 al aplicar L-DOPA.
La adquisición de proteínas contráctiles como actina, miosina, troponina y tropomiosina, que forman el sarcómero y confieren la capacidad de contracción autónoma al cardiomiocito, supone una progresión en la maduración del precursor miocárdico a miocardio maduro.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Descripción de las figuras
Fig 1. Muestra el efecto de L-DOPA y dopamina en la diferenciación de la línea de células madre embrionarias E14 a cardiomiocitos.
Los cuerpos embrionarios formados por las células E14 se cultivaron sobre superficie adherente durante 5 días en presencia o ausencia de 10 μM L-DOPA o 10 μM de dopamina. Al final del cultivo, todos los cuerpos embrionarios cultivados en las mismas condiciones se procesaron conjuntamente para extraer ARN. La expresión génica se analizó por RT-PCR cuantitativa. Los datos se expresan como la media más el error estándar de tres experimentos. C, control; DA, dopamina; L-DOPA.
Fig 2. Muestra el efecto de L-DOPA en la diferenciación de la línea de células madre embrionarias HM1 a cardiomiocitos.
Los cuerpos embrionarios formados por las células HM1 se cultivaron sobre superficie adherente durante 7 días en medio control y adicionalmente por otros 7 días en presencia o ausencia de 10 μM L-DOPA. Al final del cultivo, se disecaron los foci de latido y se procesaron para extraer ARN. La expresión génica se analizó por RT-PCR cuantitativa. Los datos están expresados respecto al control que se normalizó a 1.
Fig 3. Muestra la expresión de la tirosina hidroxilasa (TH) en el embrión de pollo por RT-PCR cuantitativa.
La TH se detecta mediante esta técnica desde estadio embrionario 4 (st) 4, alcanzándose un pico de expresión en st 8. La expresión de la misma es detectada en el Hfr (Heart formation region) de st 5, manteniéndose su expresión en tubosendocárdicos de embrión de 3 somitas (TE, 3S) y alcanzándose un pico de expresión en asa cardíaca (AC) del embrión de st 10.
Fig 4. Muestra el patrón de expresión de la TH por hibridación in situ e inmunohistoquímica.
La TH es detectada por hibridación in situ desde st 8 (5-6 somitas) , restringiéndose la expresión de la misma a los tubos endocárdicos. Mediante inmunohistoquímica, se aprecia el inicio de la expresión de la enzima en los tubos endocárdicos de st 9 (F-J) . AC, asa cardíaca; TE, tubos endocárdicos.
Fig 5. Muestra la inducción de marcadores cardíacos por L-DOPA y dopamina.
Utilizando microesferas acrílicas de heparina recubiertas de L-DOPA (B y C) o dopamina (D-F) se observa la inducción de marcadores cardíacos como VMHC1 (miosina de cadena pesada de ventrículo) (B y E) o AMHC1 (miosina de cadena pesada de aurícula) (C y F) . También se observa la inducción del factor de transcripción TBX5 (D) . En A se muestra la posición y estadio embrionario en el que se colocaron las microesferas (*) . El rectángulo indica la posición del Hfr.
Fig 6. Muestra la inhibición de la expresión de marcadores cardíacos mediante el uso de inhibidores de la ruta de biosíntesis de catecolaminas.
Microesferas impregnadas con 3-I-Tyr, inhibidor de la síntesis de L-DOPA (A) o con mHBH, inhibidor de la síntesis de dopamina (B-D) . Ambos inhibidores bloquean la expresión de los marcadores cardíacos estructurales VMHC1 (A y C) y AMHC1 (D) . Sin embargo, la expresión del factor de transcripción TBX5 no se ve alterada por mHBH (B) .
Fig 7. Muestra el efecto de la TH exógena en la expresión de marcadores cardíacos.
Los embriones de pollo fueron electroporados en st 3 y st 3+ en la línea primitiva, región por la que ingresan las células que dan lugar al mesodermo cardíaco y por ende al corazón. Para ello se utilizó un vector bicistrónico que contiene el ADNc de la proteína verde fluorescente (GFP) y el ADNc de la TH de pollo. A, B, D y E corresponden a embriones electroporados. C y F, embriones controles, no electroporados. A y D expresión de GFP que nos indica que las células que han sido electroporadas. La sobre-expresión de TH induce la expresión de las proteínas contráctiles AMHC (B) y VMHC (E) respecto a los controles (C y F) .
Ejemplos A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen el uso de las catecolaminas para la diferenciación de células madre en cardiomiocitos y la maduración de los progenitores cardiacos.
Ejemplo 1
Mantenimiento en cultivo en condiciones indiferenciadas de las ESC (del inglés Embyonic Stem Cells)
1.1. Cultivo de la línea celular E14Tg2a.IV (E14)
La línea de células madre embrionarias de ratón E14 se mantiene en condiciones indiferenciadas cultivándolas en botellas de cultivo de 25 cm2 recubiertos de gelatina a 37ºC de temperatura y 5% CO2. Para preparar las botellas de cultivo, éstas se incuban con una solución de 0, 1% gelatina (Sigma, USA) en DPBS (Dulbecco PBS) (Invitrogen, USA) a 37ºC durante al menos 5 minutos. Transcurrido este tiempo se elimina el exceso de gelatina y se dejan secar en el incubador durante 5 minutos.
Las células se dividen a una dilución 1:8 cada dos días, para ello se lavan con 3 ml de DPBS y se levantan de la superficie de cultivo incubando con 1 ml 0.05% de tripsina-EDTA (Invitrogen) a 37ºC durante 5 minutos. A continuación se detiene la acción de la tripsina añadiendo 4 ml de medio de proliferación. Las células se centrifugan a 1000 rpm durante 4 minutos, y el precipitado celular obtenido se resuspende en medio proliferativo. El medio proliferativo está compuesto por DMEM con glutamina, piruvato, 4, 5 g/l de glucosa, suplementado con 1% glutamina, 1% aminoácidos no esenciales, 0.1% 2-mercaptoetanol, 1% penicilina/estreptomicina y 10% suero fetal de temerá (FCS) (especial para células madre embrionarias) (todo de Invitrogen) . El estado indiferenciado se mantuvo añadiendo 106 unidades de ESGRO® LIF (del inglés Leukaemia Inhibitor Factor) (Chemicon, USA) por litro de medio de cultivo.
La línea E14fue cedida amablemente por la Dra. Deborah Henderson.
1.2. Cultivo de la línea celular HM1
La línea de células madre embrionarias de ratón HM1 se cultiva en estado indiferenciado sobre una capa de células nutricias, compuesta por fibroblastos embrionarios de ratón amitóticos (MEF) . Las HM1 se mantienen en medio con 15% FBS (Tabla 1) .
TABLA 1 Composición de los medios de cultivo para MEF y medio con 15% FBS utilizado para el cultivo de la línea celular HM1 
1.2.1. Obtención de cultivos primarios de fibroblastos embrionarios de ratón
Se extraen embriones de ratón 13, 5-15, 5 días de desarrollo embrionario, (E13, 5-15, 5) y se colocan en PBS estéril. Se evisceran (se eliminan la cabeza y vísceras) y nos quedamos con las carcasas. Se elimina el PBS y se ponen 2 ml de tripsina por embrión, se cortan con un bisturí y se pasan por una pipeta p10 o p20 varias veces. Se incuban a 37ºC 15 min. Se Añade 5 ml más de tripsina para seguir disgregando y se vuelven a incubar otros 10 min. a 37ºC y se vuelven a disgregar pipeteando. Se añade 20 ml de medio MEF (ver Tabla 1) , para inhibir la tripsina. El disgregado celular se pasa a un tubo cónico, se deja decantar unos segundos y el sobrenadante se pasa a un tubo falcon de 30 ml. Se centrifuga el sobrenadante 5 min. a 1000 rpm. El precipitado celular se resuspende en 10 ml de medio MEF por embrión. Se siembran 10 ml de la suspensión celular por placa de 100 mm en medio MEF. Se cambia el medio al día siguiente. Se mantiene el cultivo a 37ºC y 5% CO2.
1.2.2. Preparación de fibroblastos embrionarios amitóticos
Una vez que los fibroblastos embrionarios se encuentran próximos a la confluencia, se procesan para que se vuelvan amitóticos y puedan servir como monocapa sobre la que se cultivan las ESC. Para ello se sustituye el medio de cultivo MEF por 5 ml de medio MEF + Mitomicina C, y se incuban los fibroblastos entre 2 y 3 horas a 37ºC. Pasado este tiempo, se desecha el medio y se lavan las células 3 veces con PBS. Después se levantan de la placa de cultivo con 2, 5 ml de tripsina-EDTA incubando entre 1 y 5 minutos a 37ºC. A continuación se detiene la acción de la tripsina añadiendo 8 ml de medio MEF. Las células se despegan pipeteando varias veces, teniendo cuidado de no generar burbujas, se recogen y se depositan en un tubo de fondo cónico para poder centrifugarlas durante 5 minutos a 160 g. Pasado este tiempo se desecha el sobrenadante y se resuspenden las células en 10 ml de medio más 10% de suero de ternera. Entonces se realiza un recuento celular. Para obtener la monocapa de fibroblastos amitóticos sobre las cuales crecen las células madre embrionarias de ratón, se siembra un número determinado de fibroblastos amitóticos (106 - 1, 2 x 106 y 4 ml de medio en placa de 60 mm, 3.4 x 105 y 2 ml de medio en placa de 35 mm, 105 y 0, 5 ml de medio en placa de 10 mm) sobre placas adherentes y tratadas con 0, 1% gelatina.
Ejemplo 2
Diferenciación de las ESC a cardiomiocitos
La diferenciación de células madre embrionarias se logra usando medio de diferenciación y cultivando las células en placas bacteriológicas de 100 mm de diámetro mediante una variación del método de gota colgante descrito por Wobus (Wobus et al., 1991. Differentiation, 48: 173-182) . Dicho procedimiento permite la agregación de las células madre embrionarias para formar los denominados cuerpos embrionarios (EB, del inglés embr y onic bodies) simples.
Tanto la línea celular E14 como la HM1 se diferencian mediante este método con ligeras diferencias que se describen a continuación.
2.1- Diferenciación de las E14
2.1.1. Disposición de las células en gotas colgantes. (Día 0)
Las células indiferenciadas se lavan con DPBS, se despegan de la placa de cultivo con tripsina, y se centrifugan para eliminar la tripsina. Se elimina el sobrenadante, y el precipitado celular obtenido se resuspende en medio de diferenciación. Se realiza un recuento del número de células. Se prepara una suspensión celular de 1, 5 104 células/ml en medio de diferenciación. Se siembran 10-15 ml de la suspensión celular una placa Petri de bacterias, para evitar que las células se adhieran a la superficie de la placa. A partir de esta suspensión celular se siembran gotas de 20 μl (300 células/gota) , utilizando una pipeta multicanal o repetidora sobre la cara interna de la tapa de una placa de cultivo de 100 mm de diámetro. En la base de la placa se ponen aproximadamente 10 ml de DPBS, que servirán para mantener unas condiciones de humedad óptimas, evitando que las gotas se sequen. Se voltea la tapa que contiene las gotas sobre la base de la placa con cuidado para que estas no caigan ni se mezclen entre sí. Las placas que contienen las gotas colgantes se incuban a 37ºC y 5% CO2 durante dos días.
El medio de diferenciación está compuesto de DMEM con L-glutamina, piruvato y 4, 5 g/l glucosa, 20% FCS (suero de uso regular) , 1% glutamina, 1% aminoácidos no esenciales, 0, 1% 2-mercaptoetanol (todo de Invitrogen) .
2.1.2. Recolección de cuerpos embrionarios. (Día 2)
Después de dos días de incubación de las gotas colgantes, las células se han agregado y han formando pequeños cuerpos embrionarios. Las gotas que contienen los cuerpos embrionarios se recogen una a una con una pipeta P1000 para evitar dañar las estructuras. Se depositan en una placa Petri de bacterias a la cual le hemos añadido previamente 10-12 ml de medio de diferenciación. El número de gotas a depositar sobre cada placa es variable y depende del número de cuerpos embrionarios formados (aproximadamente 50) . Estos cuerpos embrionarios en suspensión se mantienen en cultivo a 37ºC y 5% CO2 durante tres días.
2.1.3. Siembra de cuerpos embrionarios en superficie adherente. (Día 5)
Pasados tres días, los cuerpos embrionarios en suspensión han proliferado y han adquirido un tamaño fácilmente visible. Cada uno de estos cuerpos embrionarios. Para eliminar el suero del medio de diferenciación, los cuerpos embrionarios se pasan por una placa Petri conteniendo medio de diferenciación sin suero. Después se recogen individualmente en un volumen de 250-300 μl con una pipeta P1000 y se siembran en una placa de 96 pocillos. Se deposita un cuerpo embrionario por pocillo. Una vez sembrados todos y realizado el tratamiento correspondiente con L-DOPA o dopamina, como se describe en el ejemplo 3.1, se incuban a 37ºC y 5% CO2. Transcurridas unas 5 horas el cuerpo embrionario se adhiere a la superficie de la placa y comienzan a expandirse para formar EBs císticos. En los EBs císticos pueden observarse, entre otros tipos celulares, áreas de contracción espontánea (foci de latido) , que contienen cardiomiocitos. El período de tiempo transcurrido desde que se siembra el cuerpo embrionario en placa de 96 pocillos hasta que se observan foci de latido es variable (1-4 días) .
2.2. Diferenciación de las HM1
2.2.1. Disposición de las células en gotas colgantes. (Día 0)
Las células se lavan con 2 ml de PBS y se añade 1 ml de tripsina-EDTA, manteniendo después las células durante 5 minutos a 37ºC y 5% de CO2. A continuación se despegan las células añadiendo 3 ml de medio con 15% FBS y pipeteando varias veces sin crear burbujas. Se recogen las células y se depositan en un tubo de fondo cónico para centrifugarlas durante 5 minutos a 160 g. Después se desecha el sobrenadante y se resuspenden las células en 10 ml de medio con 15% FBS. Dado que en estos 10 ml se encuentran las células madre embrionarias y los fibroblastos embrionarios amitóticos que formaban la monocapa, es necesario realizar un preplaqueo para eliminar de la mezcla los fibroblastos y utilizar sólo las células de la línea HM1 para formar los EBs simples. Para ello, la suspensión celular debe añadirse a una placa adherente de 100 mm de diámetro que haya sido gelatinizada e incubarse durante 10 minutos a 37ºC y 5% de CO2. Este tiempo es suficiente para que los fibroblastos embrionarios de la mezcla queden adheridos a la placa, mientras que las células madre embrionarias permanecen flotando en el medio debido a que su afinidad por la gelatina es ligeramente menor. Pasados los 10 minutos se recogen los 10 ml de medio que sólo contienen células madre embrionarias y se depositan en un tubo de fondo cónico.
Seguidamente se procede a la preparación de las gotas colgantes para lo cual es necesario obtener una suspensión de células madre embrionarias que contenga 1, 6 x 104 células/ml. Para ello se realiza un recuento de las células y éstas se diluyen con el volumen de medio de diferenciación que sea necesario para obtener la concentración mencionada. Las gotas se preparan empleando placas no adherentes de 100 mm de diámetro que contienen 20 ml de PBS en su base. Cada placa se destapa y mediante el uso de una pipeta multicanal se depositan gotas de 30 μl correspondientes a la suspensión celular (480 células/gota) en la parte interior de la tapa. Después, con extremo cuidado, se vuelve a tapar la placa de tal modo que las gotas permanecen colgando. De forma estándar se preparan 40 gotas por placa y de 10 a 14 placas. Las placas se incuban durante 7 días a 37ºC y 5% de CO2.
2.2.2. Recolección de los cuerpos embrionarios y diferenciación a cardiomiocitos. (Día 7)
Después de una semana se recogen los EBs simples uno a uno con ayuda de una micropipeta ajustada a un volumen de 200 μl y se cultivan en placas de 100 mm de diámetro adherentes y gelatinizadas con 10 ml de medio con 15% de suero. Cada 2 días o cuando el medio toma un color amarillento se sustituye el medio existente por medio fresco. Una vez que los EBs simples se adhieren a las placas comienzan a expandirse para formar EBs císticos. En los EBs císticos aproximadamente a los 7 días pueden observarse, entre otros tipos celulares, áreas de contracción espontánea (foci de latido) , que contienen cardiomiocitos.
Ejemplo 3
Tratamiento farmacológico con L-DOPA o dopamina
3.1. Tratamiento de las células E14 con L-DOPA o dopamina
Tanto para la L-DOPA como para la dopamina (Sigma) se preparó una solución madre de 5 mM en H2O estéril. En las células E14, L-DOPA o dopamina se aplican el día 5 (día de siembra en placa de 96 pocillo) . Los cuerpos embrionarios en suspensión se recolectan procurando coger el menor volumen de medio posible. Éstos se depositan en una placa Petri de bacterias que contiene 10 ml de medio de diferenciación sin suero al cual se le ha añadido L-DOPA o dopamina a una concentración final de 10 μM. A la placa control se le añade un volumen de H2O estéril equivalente al volumen añadido en los tratamientos farmacológicos. Estos cuerpos embrionarios se recogen en 270 μl del medio en el cual se encuentran, y se siembran, uno por pocillo, en una placa de 96 pocillos. Cada día se renuevan 200 de los 270 μl de medio que contiene cada pocillo con medio de diferenciación sin suero conteniendo el tratamiento farmacológico durante 5 días.
3.2. Tratamiento de las células HM1 con L-DOPA
Los cuerpos embrionarios de la células HM1 se trataron con 10 μM L-DOPA cuando comenzaron a aparecer los foci de latido, aproximadamente a los 7 días de siembra en superficie adherente, que corresponde al día 14 del proceso de diferenciación. Los cuerpos embrionarios se cultivaron adicionalmente durante 6 días en presencia o ausencia de 10 μM L-DOPA renovando cada día el medio de cultivo.
Ejemplo 4
Extracción de ARN
4.1. Extracción de ARN de los cuerpos embrionarios de las células E14
Después de 5 días de tratamiento se recogen conjuntamente todos los cuerpos embrionarios que corresponden al mismo tratamiento y se homogenizaron con 1 ml de trizol (Invitrogen) . El lisado se mantiene a temperatura ambiente (TA) 5 minutos, y se añaden 0, 2 ml de cloroformo. Se agita vigorosamente y se mantiene 2 ó 3 minutos a TA. Se centrifuga a 12000 rpm, durante15 minutos a 4ºC. Se transfiere la fase acuosa (sobrenadante) a otro tubo y se le añade 1 μl de glucógeno (20 μg/μl) . El glucógeno actúa como transportador del ARN para favorecer su precipitación. Después se añade 0, 5 ml de alcohol isopropílico. Se incuban las muestras a TA 10 minutos, y se centrifugan a 12000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. Se elimina el sobrenadante, y el precipitado se lava con 1 ml de 70% etanol. Se centrifuga a 12000 rpm, 5 minutos, a 4ºC. Se elimina el etanol, y el precipitado se deja secar a TA durante 5 minutos. El precipitado (ARN) , se resuspende en agua estéril. La cuantificación del ARN se realiza con un NanoDrop (ThermoTM Scientific, USA) , y se comprueba la calidad del mismo mediante electroforesis en gel de 0.8% agarosa en Tris Borato-EDTA (TBE) corrido a 140 voltios, 10 min.
4.2. Extracción en las áreas de latido de las células HM1
Los foci de latido son recortados a los 6 días de tratamiento, recogiendo conjuntamente todos los foci correspondientes al mismo tratamiento. La extracción de ARN se realiza como se detalla en el apartado 4.1.
Ejemplo 5
RT-PCR a tiempo real
5.1. RT (del inglés Reverse Transcriptase)
Antes de realizar la transcripción reversa se trató el ARN con ADNsa para eliminar cualquier posible contaminación con ADN genómico. Típicamente se incubaron 1-5 μg de ARN con 1 μl de DNasa (Invitrogen) durante 15 minutos a 37ºC. La reacción se paró con. Éste ARN se incubó con una mezcla que contiene 1 μl de oligonucleótidos sintéticos degenerados p (dN) 6, 1 μl de 10 mM dNTP Mix (todo de Invitrogen) , y H2O destilada estéril hasta completar un volumen de 13 μl. Esta mezcla se calienta a 65ºC durante 5 minutos, y posteriormente se incuba en hielo 1 minuto. A la mezcla anterior se añade 4 μl de 5X First Strand Buffer, 1 μl de 0, 1M DTT, 1 μl de RNaseOUT y 1 μl de SupersScriptTM III RT. La nueva mezcla se incuba a 50ºC durante 1 hora. La reacción de la transcriptasa se para calentando la muestra a 70ºC durante 15 minutos.
5.2. PCR cuantitativa
La PCR cuantitativa (PCRq) se realiza con el ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania) usando la TaqMan Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG (Applied Biosystems) y sondas de the Universal Probé Librar y (UPL) (Roche Applied Science) para la detección. Esta reacción se lleva a cabo en la Unidad de Genómica del Parque Científico de Madrid, en la Facultad de Biología de la Universidad Complutense de Madrid. La secuencia de los cebadores de ratón y sus sondas UPL respectivas se describen a continuación:
(Tabla pasa a página siguiente)
Típicamente, las retrotranscriptasas (RTs) se diluyen 1:10, y para la PCRq se utilizan 5 μl de RT de esta dilución, 5, 4 μl H2O, 10 μl Master Mix, 0, 2 μl de sonda y 0, 2 μl de cada uno de los cebadores. Las condiciones de amplificación son: 95ºC-10 minutos para desnaturalizar el ADN, y 40 ciclos de amplificación de 95ºC-15 minutos y 60ºC-1 minuto.
Como gen normalizador se utilizó el 18S ARN ribosómico. Tanto para los genes experimentales como para el normalizador se utilizó como curva estándar RT de ARN de corazón embrionario de ratón E14. Esta RT se preparó a partir de 5 μg de ARN.
Ejemplo 6
Aumento de la expresión de marcadores cardíacos por L-DOPA y dopamina en células E14
La línea de células madre embrionarias de ratón E14 se diferenció mediante el cultivo en gotas colgantes durante dos días. Posteriormente, los EBs formados se crecieron en suspensión durante tres días. Seguidamente los EBs se sembraron individualmente sobre placas de 96 pocillos. En este momento se comenzó el tratamiento de los EBs con 10 μM de L-DOPA o 10 μM dopamina. Aproximadamente un 75% del medio de cultivo era renovado diariamente para evitar la degradación de las drogas utilizadas. Después de 5 días, todos los cuerpos embrionarios correspondientes al mismo tratamiento se recogieron para la extracción de ARN y posterior realización de RT-PCR cuantitativa.
Como se muestra en la gráfica de la Fig 1, los EBs tratados con L-DOPA y dopamina presentan un aumento de la expresión de factores de transcripción específicos del linaje cardíaco Nkx2.5, GATA4 y TBX5 de entre dos y tres veces con respecto al control. Un aumento más modesto se observó en la expresión de TBX2. Paralelamente, los tratamientos con L-DOPA y dopamina dieron lugar a un aumento en la expresión de las proteínas contráctiles α MHC y TT2.
Dado que se produce un aumento en la expresión de los factores de transcripción que disparan y estabilizan el programa genético cardiaco con los la L-DOPA y dopamina éstas estarían repercutiendo en el inicio de la diferenciación de las células madre a cardiomiocitos. Así mismo la estimulación en la expresión de proteínas contráctiles indica que también favorece la maduración de los cardiomiocitos.
Además en estos experimentos, los EBs se diferenciaron en medio sin suero (ver materiales y métodos) , por lo que el efecto observado en el aumento de la expresión de factores de transcripción específicos de cardiomiocitos así como de proteínas contráctiles es debido a la acción de la L-DOPA o la dopamina.
Ejemplo 7
Efecto de L-DOPA en maduración de cardiomiocitos
Las células HM1 se diferenciaron en gotas colgantes durante 7 días. Una vez formados los EBs, los mismos se plaquearon en condiciones adherentes. Una vez que eran detectadas áreas de latido en los EBs, una semana después del plaqueo, se comenzó el tratamiento con 10 μM L-DOPA durante 6 días. El medio de cultivo se renovaba diariamente. A los 6 días de tratamiento, todas las áreas de latido correspondientes al mismo tratamiento (L-DOPA, o control) , se recogían conjuntamente. La extracción de ARN y posterior RT-PCR a tiempo real se realizó igual que en las células E14.
Como puede observarse en la Fig 2, la L-DOPA induce de forma dramática los niveles de expresión de proteínas contráctiles, aumentando entre 10 y 100 veces (1 y 2 órdenes de magnitud) los niveles de β-MHC (miosina de cadena pesada) , MLC2A y MLC2V (ambas miosinas de cadena ligera) . En el caso de α-actina, Troponina T2 y α MHC (miosina de cadena pesada) el aumento de los niveles se sitúa entre 100 y 1000 veces (2 y 3 órdenes de magnitud) por encima del control. También se observó un aumento pero de menor magnitud (de dos veces) en la expresión del factor de transcripción TBX5.
En este caso, la L-DOPA parece tener un papel importante en la maduración de los cardiomiocitos.
Por otro lado, tanto la L-DOPA como la dopamina inhiben la expresión de marcadores específicos de otros linajes celulares diferentes al linaje cardíaco (datos no mostrados) .
Diferentes factores de crecimiento tales como TGFβ y BMP-2 (Behfar et al., 2002. Faseb J., 16: 1558-1566) , Wnt/β-catenina (Naito et al., 2006. PNAS USA. 103: 19812-19817) , oxitocina (Hatami et al., 2007. Int. J. Cardiol., 117: 80-89) y varios compuestos químicos como ácido retinóico (Wobus et al., 1997. Differentiation. 48: 173-182) , ácido ascórbico (Takahashi et al., 2003. Circulation. 107: 1912-1916) han mostrado efecto inductor de la diferenciación de células stem a cardiomiocitos.
De esta forma tanto la L-DOPA como la dopamina se sumarían a la lista de factores de crecimiento y compuestos químicos capaces de potenciar la diferenciación de células madre embrionarias a cardiomiocitos.
Ejemplo 8
Patrón de expresión de la tirosina hidroxilasa (TH) en células cardíacas del embrión de pollo
8.1. Determinación del patrón de expresión por RT-PCR cuantitativa (Fig 3)
En el embrión de pollo en gastrulación (estadio 5) las células que van a formar el tubo cardiaco se sitúan lateralmente a la línea primitiva, en una región conocida como Hfr (del inglés Heart forming region) . La TH es detectada por RT-PCR cuantitativa en la Hfr. La expresión de la misma se mantiene en los tubos endocárdicos (TE) del embrión de estadio 8 (st 8) , y se alcanza un pico de expresión en asa cardíaca (AC) del embrión de st 10. La RT-PCR cuantitativa se lleva a cabo según lo descrito en el ejemplo 5 pero utilizando cebadores específicos para el gen de la TH de pollo. Como gen normalizador se utilizó la GAPDH de pollo.
8.2. Determinación del patrón de expresión por hibridación in situ (Fig 4)
La TH es detectada mediante hibridación in situ desde st.8. Dicha expresión aparece restringida a los tubos cardíacos en este estadio, manteniéndose la misma en el corazón hasta st.35 (estadio más avanzado que ha sido estudiado) . La expresión proteica de la enzima detectada por inmunohistoquímica en los tubos endocárdicos desde st.9.
8.3. Determinación de la actividad funcional de la TH endógena de pollo
En el embrión de pollo de st10 se ha detectado L-DOPA mediante HPLC, mostrándose así que la enzima endógena es funcional.
Ejemplo 9
Inducción de marcadores cardíacos por L-DOPA y dopamina (Fig 5)
Las microesferas acrílicas de heparina (Sigma) , son usadas habitualmente en biología del desarrollo por su capacidad de adherir a su superficie diferentes sustancias tales como ácido retinóico, factores de crecimiento (FGFs, etc) . El tipo de unión o adhesión de dichas moléculas, así como la forma de liberación de las mismas se desconoce.
Las microesferas se seleccionaron en función del tamaño, utilizándose en nuestro estudio aquellas que poseían 150 μm de diámetro. Estas microesferas se incubaron durante al menos 4 horas en una gota que contiene la sustancia objeto de estudio a la concentración deseada. Como control de la DOPA y de la dopamina, se usaron microesferas incubadas en PBS. Como control de la 3-I-Tyr se usaron microesferas incubadas en HCl, al ser este utilizado para la correcta disolución de la droga.
Transcurrido el tiempo de incubación, las microesferas se implantaron en los embriones de estadios y posiciones descritas. Para ello, se colocaron los embriones en cultivo EC (Chapman et al., 2001. Dev Dyn. 220: 284-289) , con la parte ventral hacia arriba. Se realizó una pequeña incisión en el endodermo del embrión en la posición deseada, utilizando para ello espinas de cactus. Las microesferas se depositaron sobre dicha incisión ayudados por unas pinzas. Utilizando de nuevo una espina de cactus, las microesferas se implantaron en la cavidad existente entre el endodermo y el ectodermo embrionario.
Al implantar microesferas acrílicas de heparina recubiertas de L-DOPA o dopamina laterales al Hfr st 5 y tras 12 horas de incubación, hemos detectado la inducción ectópica, en torno a dichas microesferas, de proteínas contráctiles cardíacas como AMHC (miosina auricular de cadena pesada) , VMHC (miosina ventricular de cadena pesada) , y de factores de transcripción implicados en desarrollo cardiaco como Tbx5.
Esta inducción es dependiente de la región donde se implante la microesfera. Así, microesferas se colocan en st 5, dentro del Hfr, o en st 4 en posición lateral al nódulo de Hensen o dentro de las crestas germinales, no se produce inducción de marcadores cardíacos. Tampoco fue detectada la inducción de otros marcadores específicos de mesodermo.
Ejemplo 10
Inhibición de marcadores cardíacos por 3-yodo-tirosina y tetahidroxibenzilhidrazina. (Fig 6)
La 3-yodo-tirosina (3-I-Tyr) es un inhibidor de la síntesis de L-DOPA. Microesferas impregnadas con 3-I-Tyr e implantadas laterales al Hfr tras una incubación de 4-6 horas inhiben la expresión endógena de las proteínas contráctiles AMHC y VMHC. Así mismo, microesferas impregnadas con metahidroxibenzilhidracina (mHBH) que es un inhibidor de la biosíntesis de dopamina, disminuye la expresión endógena de proteínas AMHC y VMHC. Estos marcadores cardíacos se detectaron mediante la técnica de hibridación in situ. Dicha técnica consiste en la detección del ARN mensajero (ARNm) de interés, mediante la utilización de una sonda de ARN marcada y complementaria al ARNm objeto de estudio. La sonda se genera mediante la transcripción in vitro a partir de su ADN complementario (ADNc) introducido en un vector de expresión.
Para generar cada sonda típicamente se liniarizaron 10 μg del plásmido que contiene el ADNc con una enzima de restricción que corta 5' aguas arriba del ADNc. Esta digestión se realizó utilizando 100 unidades de enzima de restricción durante 2 horas a la temperatura a la cual es activa dicha enzima. Transcurrido este tiempo, se comprobó que todo el vector presente en la muestra está linearizado. Para ello se realizó una electroforesis de 200-300 ng de la digestión en un gel de agarosa al 1% en Tris-Borato-EDTA (TBE) . El plásmido completamente linearizado se extrajo con un volumen de fenol/cloroformo/isoamil alcohol (25:24:1) y se centrifugó durante 2 minutos a 4ºC a 12000 rpm. Se realizó una segunda extracción con un volumen de cloroformo/isoamil alcohol (24:1) . Se recogió el sobrenadante y se precipitó con 2, 5 volúmenes de etanol absoluto y 0, 1 volúmenes de acetato sódico 3 M pH 5, 2 durante al menos 1 hora a -20ºC. Se centrifugó durante 20 minutos a 12000 rpm y 4ºC. El precipitado obtenido se lavó con un volumen de 70% etanol. Tras el lavado, el precipitado se dejó secar a temperatura ambiente durante 5 minutos, y se resuspendió en 50 μl de agua libre de nucleasas.
Para la síntesis de la sonda se incubó 1 μg de plásmido linearizado con 2 μl de 10X buffer de transcripción, 2 μl de 0, 1 M ditiotreitol (DTT) , 2 μl de 10X nucleótidos marcados con digoxigenina, 0, 5 μl de inhibidor de RNasas, 1 μl de ARN polimerasa (SP6, T7 ó T3) (todo de Roche) y hasta completar un volumen de 20 μl con agua libre de RNasas, a 37ºC durante 2 horas. La sonda sintetizada se precipitó con 16, 4 μl de agua libre de nucleasas, 1, 6 μl de 0, 5 M etilendiaminotetraacético (EDTA) , 2 μl de 8 M cloruro de litio y 120 μl de etanol absoluto durante 2 horas a -20ºC. Se centrifugó transcurrido este tiempo a 12000 rpm durante 20 minutos a 4ºC. El precipitado obtenido se lavó con 70% etanol. El precipitado se resuspendió en 100 μl de 10 mM EDTA. Para comprobar la calidad de las sondas generadas, éstas se fraccionaron en geles de agarosa 0, 8% (p/v) en TBE.
Los embriones completos de pollo se fijaron en 4% PFA en PBS, previamente tratado con DEPC y esterilizado, durante al menos 16 horas a 4ºC. Se lavaron con PBT (PBS-DEPC, 0, 1%Tritón X-100) y a continuación se deshidrataron mediante soluciones seriadas de metanol en PBT a concentraciones crecientes (25%, 50%, 75%) durante 10 minutos cada una, y se lavaron dos veces con metanol 100%. La rehidratación de las muestras se realizó con las mismas soluciones de metanol en sentido inverso y se lavaron dos veces con PBT, 5 minutos cada vez.
Para eliminar la actividad peroxidasa endógena de las muestras, éstas se trataron con 1% H2O2 durante 5-30 minutos (depende del estadio embrionario; por ejemplo, 15 minutos para st 10) a temperatura ambiente y en oscuridad. Posteriormente se lavaron con PBT durante 5 minutos.
Para mejorar su permeabilización se trataron con 10 μg/ml de proteinasa K (Promega) durante un tiempo variable dependiendo del estadio (4 minutos para st 4-7; 7 minutos st 7-10; 9 minutos st 11-13) a temperatura ambiente y se lavaron con PBT durante 5 minutos. Posteriormente se refijaron los embriones con 4% PFA en PBT durante 20 minutos a temperatura ambiente y se lavaron con PBT durante 5 minutos.
Los embriones se preincubaron con tampón de hibridación durante 5 minutos a 57-60ºC. Dicho tampón está compuesto de una mezcla de 50% de formamida (v/v) , 5XSSC, 2% (p/v) de Boehringer Blocking Powder (Roche) , 0, 1% (v/v) de Tritón X-100, 50 μg/ml de heparina (Sigma) , 1 mg/ml de ARN de transferencia (Sigma) , 5 mM EDTA, 0, 1% (p/v) de CHAPS (Calbiochem, Alemania) en agua DEPC. Las ribosondas se desnaturalizaron en esta misma solución a 70ºC durante 5 minutos. Transcurrido el tiempo de preincubación, se incubaron los embriones en el tampón de hibridación en presencia de 1 μg/ml de la ribosonda durante al menos 16 horas a 57-60ºC. Se lavaron a la misma temperatura de hibridación, con 2XSSC, 0, 1% (p/v) CHAPS (5 veces) 5 minutos las dos primeras y 20 minutos las 3 restantes. Posteriormente con 0, 2XSSC, 0, 1%CHAPS, 3 veces durante 20 minutos cada vez. Se realizaron tres lavados con 0, 1% KTBT (Tris-HCl 50 mM, pH 7, 5, NaCl 150 mM, KCl 10 mM, 0, 1% Tritón X-100) durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente.
Para la detección de los nucleótidos marcados con digoxigenina primero se bloquearon los embriones con 15% de suero fetal bovino (Invitrogen) (v/v) , 0, 7% de Boehringer Blocking Powder en 0, 1% KTBT durante 2-3 horas a 4ºC. Posteriormente los embriones se incubaron con una dilución de anticuerpo primario anti-digoxigenina conjugado con fosfatasa alcalina 1/1000 (Roche) en solución de bloqueo fresca durante al menos 16 horas a 4ºC. Tras la incubación se lavaron los embriones (durante al menos 3 horas cambiando la solución cada 30 minutos) con 0, 3% KTBT (50 mM Tris-HCl, pH 7, 5, 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 0, 3% Tritón X-100) y posteriormente se dejaron lavando durante 16 horas más con esta solución a 4ºC. Se realizaron 3 lavados de 15 minutos cada uno con NTMT (100 mM Tris-HCl, pH 9, 5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0, 1% Tween, 1 mM levamisol (Sigma) ) . Se incubaron los embriones en oscuridad con 3 μl de azul de nitrotetrazolio (NBT) y 2, 3 μl de 5-bromo-4-cloro-3-indosil-fosfato (BCIP) (Roche) en 1 ml de NTMT. Cuando el desarrollo del color azul típico del NBT/BCIP fue óptimo la reacción se paró lavando los embriones con 0, 3% KTBT y se visualizaron los embriones en un microscopio Axioskop de Zeiss (Oberkochen, Alemania) bajo la luz visible.
Todos los pasos de la hibridación in situ, salvo el de la proteinasa K, se realizaron en agitación.
Ejemplo 11
Efecto de la tirosina hidroxilasa (TH) por electroporación. (Fig 7)
Además de los experimentos farmacológicos descritos anteriormente hemos realizado experimentos genéticos de ganancia de función. Embriones de pollo en st 3 y st 3+ fueron electroporados en la línea primitiva, región por la que están migrando las células que darán lugar al corazón, con el ADNc de la TH de pollo. En los embriones electroporados se observó mediante hibridación in situ un notable aumento en la expresión de las miosinas auriculares y ventriculares (AMHC y VMHC) en los tubos cardiacos y en el corazón.
Sin embargo, no se indujo dicha expresión en las células electroporadas cuyo destino final no fue el corazón.
